刁巧虹，卞國志，王 娟，羅藹劍，張 瑩，高瀟祎，賈 坤，孫凌霜*，袁建豐*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；3.廣東海大集團股份有限公司，廣東廣州 511400；4.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣東廣州 5106421)

奶牛乳房炎常見致病菌多重PCR檢測方法的建立

刁巧虹1,2,4，卞國志1,3，王 娟2,3，羅藹劍1,4，張 瑩1,4，高瀟祎1，賈 坤1,4，孫凌霜1,4*，袁建豐2,3*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；3.廣東海大集團股份有限公司，廣東廣州 511400；4.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣東廣州 5106421)

為建立同時快速檢測奶牛奶樣中無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的方法，根據(jù)無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、乳房鏈球菌pauA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因各設(shè)計1對特異性引物，建立多重PCR檢測體系。結(jié)果顯示，該檢測方法具有高特異性，無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌敏感性分別為105、104、105、105CFU/mL。對臨床采集的460份奶樣檢測結(jié)果表明，建立的多重PCR體系可以用于臨床上無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的檢測。

乳房炎；多重PCR；無乳鏈球菌；停乳鏈球菌；乳房鏈球菌；金黃色葡萄球菌

奶牛乳房炎是危害奶牛生產(chǎn)的重要臨床疾病之一，是世界奶牛業(yè)的主要危害因素之一，據(jù)報道我國奶牛乳房炎的發(fā)病率為41%～60%[1-2]，不僅引起產(chǎn)奶量的減少及其品質(zhì)下降，造成嚴重的經(jīng)濟損失，某些病原體還可引起人類感染[3-4]。奶牛乳房炎常呈混合性感染，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)和停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)是最常見的病原[5]。目前，對于動物細菌的檢測主要還是依靠傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)、生化鑒定等方法，其操作繁瑣、耗時長、敏感性較低，不能適應(yīng)快速檢測的需要[6]。因此，建立一種同時檢測多種病原的快速檢測技術(shù)體系，對奶牛乳房炎的定期檢測、混合感染和及時診斷和防治有重要意義。

普通PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)、基因芯片、凝集法等均有應(yīng)用于細菌檢測領(lǐng)域。奶牛乳房炎經(jīng)常出現(xiàn)多種病原混合感染的情況，以上的方法檢測通量均不高，采用多重PCR，可以實現(xiàn)一次快速檢測多種病原菌，尤其適用于乳房炎的檢測。本研究建立無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測體系，為奶牛乳房炎的快速診斷提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)和沙門菌(Salmonella)為本實驗室分離保存菌株。

1.1.2 主要試劑 PCR及連接轉(zhuǎn)化相關(guān)制劑為TAKARA產(chǎn)品；大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、大豆胰蛋白胨培養(yǎng)基(TSB)為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、革蘭染色液為青島海博生物公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為Omega產(chǎn)品；快速質(zhì)粒小提試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA小量試劑盒為AxyPrep產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或試劑純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌表面免疫相關(guān)蛋白(surface immunogenic proteins，sip)基因(HQ878436)，停乳鏈球菌免疫分泌蛋白(immunogenic secreted protein，isp)基因(CP002215)，乳房鏈球菌纖溶酶原激活物A(plasminogen activactor A，pauA)基因(KT006567.1)，金黃色葡萄球菌菌耐熱核酸酶(thermonuclease，nuc)基因(DQ399678)，各設(shè)計了1對特異性引物(表1)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物名稱及其序列

1.2.2 模板DNA制備 按照AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒說明書操作，提取細菌DNA模板，置-20℃保存。

1.2.3 pMD-18T重組載體的構(gòu)建 分別通過GenBank中無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌免疫分泌蛋白isp基因、乳房鏈球菌pauA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因的標準參考序列，人工合成相應(yīng)基因的模板序列，連接到pMD-18T載體，構(gòu)建4種含有目的基因的重組載體。

1.2.4 PCR條件優(yōu)化 以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌4種菌的基因組DNA為多重PCR反應(yīng)模板，先用單重PCR方法對退火溫度進行優(yōu)化。根據(jù)單重PCR優(yōu)化結(jié)果，再對多重PCR退火溫度、引物濃度、Taq酶、MgCl2濃度、dNTP濃度等進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 特異性試驗 以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、蠟樣芽胞桿菌和肺炎鏈球菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，以檢測其特異性。

1.2.6 敏感性試驗 無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌分別以pMD-18T-sip、pMD-18T-isp、pMD-18T-pauA和pMD-18T-nuc4種重組載分別做10倍梯度稀釋，取108、107、106、105、104、103、102CFU/mL 7個濃度梯度分別為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，檢測其敏感性。

1.2.7 臨床奶樣的檢測 用多重PCR方法對廣東地區(qū)10個規(guī)模化奶牛場隨機采集的460份臨床奶牛奶樣進行檢測，同時用傳統(tǒng)細菌分離結(jié)合16S rRNA測序鑒定法進行復(fù)檢。

2 結(jié)果

2.1 pMD-18T重組載體的構(gòu)建

對擴增sip基因、isp基因、pauA基因和nuc基因進行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建的重組載體測序結(jié)果為，經(jīng)比對pMD-18T-sip與sip基因序列同源性為99%，pMD-18T-isp與isp基因序列同源性為99%，pMD-18T-pauA與pauA基因序列同源性為100%，pMD-18T-nuc與nuc基因序列同源性為99%。說明成功構(gòu)建了這4種基因的重組載體。

2.2 多重PCR優(yōu)化結(jié)果

通過固定無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌4種菌的基因組DNA模板濃度，在單重PCR的基礎(chǔ)上，對多重PCR退火溫度、引物濃度、Taq酶、MgCl2濃度、dNTP濃度等進行優(yōu)化，最終確定多重PCR最佳反應(yīng)條件(50 μL)為：Taq酶 2.50 U，10×PCR buffer 5 μL， 1.5 mmol/L MgCl2， 200 μmol/L dNTP，無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌引物濃度分別為0.05、0.06、0.16、0.16 μmol/L，50 ng/μL DNA模板，雙蒸水補足50 μL；反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，50℃ 1 min，72℃ 1min 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

2.3 特異性試驗結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、蠟樣芽胞桿菌和肺炎鏈球菌基因組DNA為模板，進行多重PCR擴增，無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌為模板均能擴增出相應(yīng)605、385、273、155 bp的目的條帶。而對大腸埃希菌、沙門菌、肺炎鏈球菌和蠟樣芽胞桿菌的擴增結(jié)果均為陰性，特異性好(圖1)。

2.4 敏感性試驗結(jié)果

無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌分別以pMD-18T-sip、pMD-18T-isp、pMD-18T-pauA和pMD-18T-nuc4種重組載分別用雙蒸水做梯度稀釋，取108、107、106、105、104、103、102CFU/mL 7個濃度梯度分別為模板，設(shè)置pMD-18T-sip、pMD-18T-isp、pMD-18T-pauA和pMD-18T-nuc4種重組載體為陽性對照，設(shè)置雙蒸水為陰性對照。分別進行PCR擴增反應(yīng)。結(jié)果顯示，無乳鏈球菌多重PCR的檢測限為105CFU/mL(圖2)；停乳鏈球菌多重PCR的檢測限為104CFU/mL(圖3)；乳房鏈球菌多重PCR的檢測限為105CFU/mL(圖4)；金黃色葡萄球菌多重PCR的檢測限為105CFU/mL(圖5)。

M.DNA標準DL 1 000 ; 1.無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌; 2.無乳鏈球菌; 3.停乳鏈球菌; 4.乳房鏈球菌;5.金黃色葡萄球菌; 6.沙門菌; 7.大腸埃希菌; 8.蠟樣芽胞桿菌; 9.肺炎鏈球菌; 10.陰性對照; 11.陽性對照

M.DNA Marker DL 1 000 ; 1.S.agalactiae,S.dysgalactiae,S.uberisandS.aureus; 2.S.agalactiae; 3.S.dysgalactiae; 4.S.uberis; 5.S.aureus;6.Salmonella; 7.E.coli; 8.B.cereus; 9.S.pneumoniae; 10.Negative control; 11.Positive control

圖1多重PCR特異性試驗

Fig.1 Specificity test of multiplex PCR

M.DNA標準DL 1 000; 1～7.108 CFU/mL～102 CFU/mL; 8.陰性對照; 9.陽性對照 M.DNA Marker DL 1 000 ; 1-7.108 CFU/mL-102 CFU/mL; 8.Negative control; 9.Positive control

M.DNA標準DL 1 000; 1～7.108 CFU/mL～102 CFU/mL; 8.陰性對照; 9.陽性對照 M.DNA Marker DL 1 000 ; 1-7.108 CFU/mL-102 CFU/mL; 8.Negative control; 9.Positive control

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

采用多重PCR方法對廣東地區(qū)10個規(guī)模化奶牛場隨機采集460份臨床奶樣進行檢測，共檢測出無乳鏈球菌22份(4.78%)，停乳鏈球菌10份(2.17%)，乳房鏈球菌40份(8.70%)，金黃色葡萄球菌29份(6.30%)，其中含有2種及以上目標菌的奶樣有9份(表2)。與傳統(tǒng)細菌分離結(jié)合16S rRNA測序鑒定法相比較，多重PCR的檢出率高于傳統(tǒng)細菌分離方法，共有59份結(jié)果不同，符合率為87.17%。

M.DNA標準DL 1 000; 1～7.108 CFU/mL～102 CFU/mL; 8.陰性對照; 9.陽性對照 M.DNA Marker DL 1 000 ; 1-7.108 CFU/mL-102 CFU/mL; 8.Negative control; 9.Positive control

細菌Bacteria無乳鏈球菌S．a(chǎn)galactiae停乳鏈球菌S．dysgalactiae乳房鏈球菌S．uberis金黃色葡萄球菌S．a(chǎn)ureus陽性奶樣總數(shù)Totalpositivecase陽性奶樣/總數(shù)(陽性率)Positivecase/Total(Positiverate)22/460(4．78%)10/460(2．17%)40/460(8．70%)29/460(6．30%)91/460(19．78%)

3 討論

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見的疾病之一，嚴重影響奶牛業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展。建立簡單、快速的乳房炎常見致病菌的診斷方法，對加強疾病的防治和減少抗生素的使用有重要的意義[8]。多重PCR方法的優(yōu)勢在可以同時對多種病原進行檢測，在縮短檢測周期的同時節(jié)約了檢測材料[9]。奶牛乳房炎致病菌繁多，經(jīng)常出現(xiàn)混合感染，無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌是最常見的病原，特別適合建立多重PCR檢測體系。本研究建立多重PCR所選取的無乳鏈球菌sip[10]基因，停乳鏈球菌isp[11]基因，乳房鏈球菌pauA[12-13]基因，金黃色葡萄球菌nuc[14-15]基因都具有高度保守又廣泛存在的特點。結(jié)果顯示，這4個基因具有良好的特異性；體系敏感性在104～105CFU/mL之間，與單重PCR相比下降了102～103倍，這可能與引物間的相互作用有關(guān)。通過對460份臨床奶樣進行檢測結(jié)果表明，該方法能夠準確的檢測出臨床奶樣中的無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌，對臨床奶樣檢測的結(jié)果與傳統(tǒng)細菌分離鑒定法相比，多重PCR方法對4種菌有著更高檢出率，檢測結(jié)果符合率為87.17%，這與傳統(tǒng)細菌分離鑒定的靈敏度較低有一定的關(guān)系[16]，表明多重PCR法與傳統(tǒng)分離法相比擁有更高的靈敏度，能夠滿足臨床上這4種菌的單一或者混合感染的快速檢測。

綜上所述，本試驗建立的多重PCR方法具有快速、簡便、特異性強、靈敏度高的特征，可有效用于臨床上奶牛乳房炎中無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的檢測，適用于大量樣本的流行病學調(diào)查。

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DevelopmentofaMultiplexPolymeraseChainReactionAssayforDetectionofCommonPathogensinCowMastitis

DIAO Qiao-hong1,2,4,BIAN Guo-zhi1,3,WANG Juan2,3,Luo Ai-jian1,4,ZHANG Ying1,4, GAO Xiao-yi1,JIA Kun1,4,SUN ling-shuang1,4,YUAN Jian-feng2,3

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou，Guangdong,510642,China; 2.GuangdongHaidInstituteofAnimalHusbandry&Veterinary,Guangzhou,Guangdong,511400,China; 3.GuangdongHaidGroupCo.,Limited,Guangzhou,Guangdong,511400,China；4.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPreventionandControlforSevereClinicalAnimalDiseases,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

To establish a rapid assay forStreptococcusagalactiae,Streptococcusdysgalactiae,StreptococcusuberisandStaphylococcusaureusdetection,in this study,four pairs of specific primers were designed according to the sequences published in GenBank,by thesipgene ofStreptococcusagalactiae,ispofStreptococcusdysgalactiae,pauAofStreptococcusuberisandnucofStaphylococcusaureus.Development of the PCR assay for detection of these bacteria.The result showed that the assay had the advantages of high sensitivity and good specificity,the sensitivity ofS.agalactiae,S.dysgalactiae,S.dysgalactiae,S.uberisandS.aureuswere 105CFU/mL,104CFU/mL,105CFU/mL and 105CFU/mL,respectively.The performance of the multiplex PCR was evaluated by examining 460 clinical mastitis milk samples.The results showed that the multiplex PCR can be used for detection these four bacteria in milk samples.

Mastitis; multiplex PCR;Streptococcusagalactiae;Streptococcusdysgalactiae;Streptococcusuberis;Staphylococcusaureus

2017-04-10

廣州市科技計劃項目(201510010250);廣東省科技計劃項目(2014A020208052，2015B020203005，2015A020224039);廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室項目(2013A061401013);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)項目(2016LM2150);廣州市珠江科技新星專項(201610010073)

刁巧虹(1991-)，女，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學研究。*

S857.26

A

1007-5038(2017)12-0059-05