張雪芳,余 倩,吳昌正,2,3,4,肖 瓊,2,3,4,朱艷冰,2,3,4,肖安風,2,3,4,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021; 2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021; 3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心,福建廈門 361021; 4.廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021)

張雪芳1,余 倩1,吳昌正1,2,3,4,肖 瓊1,2,3,4,朱艷冰1,2,3,4,肖安風1,2,3,4,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021; 2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021; 3.福建省海洋功能食品工程技術研究中心,福建廈門 361021; 4.廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021)

為改進卡拉膠寡糖的制備工藝,本研究以κ-卡拉膠為底物,采用酶法制備κ-卡拉膠寡糖,以還原糖生成量為評價指標,對酶解條件進行優(yōu)化,并采用薄層色譜法及質譜對酶解產物進行分析。結果顯示酶解反應最優(yōu)工藝條件為:底物濃度12 g/L、pH7.0、反應溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min,經優(yōu)化后的酶解反應更完全,還原糖生成量由0.91 mg/mL提高至1.61 mg/mL,提高了77%,酶解卡拉膠反應的Km值為171.96 mg/mL,最大反應速度Vmax為0.925 mg·mL-1·min-1。最優(yōu)工藝驗證實驗和20 L放大實驗結果一致,經薄層色譜及質譜分析酶解24 h后的反應主產物為二糖和四糖。

卡拉膠,卡拉膠寡糖,酶水解

卡拉膠(Carrageenan)是從紅藻細胞壁中提取的一種水溶性線性硫酸半乳聚糖,具有以1,3-β-D-半乳糖和1,4-α-D-半乳糖交替連接形成的骨架結構,其分子量為105～106u。根據是否含有3,6-內醚半乳糖、硫酸根含量及硫酸根所在位置,主要將卡拉膠分為κ-、λ-、τ-三族[1-2]。

卡拉膠作為一種天然海藻多糖,因其安全、無毒,可生物降解、自然界存在量大,及特殊的理化特性而在食品、藥品和化妝品等行業(yè)大量應用[3]。然而,由于卡拉膠分子量大,溶解性及吸收性差,從而影響卡拉膠的生物活性并限制了卡拉膠的進一步應用。研究表明,經降解或改性得到的卡拉膠寡糖或低聚糖及衍生物具有抗?jié)?、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血[4-7]等多種作用,生物活性與利用率得到更大提高[8]。

由于對寡糖、低聚糖的制備技術研究還不夠成熟,制備成本高,限制了寡糖、低聚糖規(guī)?；瘧蒙a[9]。因此,研究或改進生產制備工藝、降低成本、提高得率是寡糖、低聚糖擴大應用的關鍵。目前,卡拉膠的降解方式主要有化學降解法,如:氧化降解[10]、酸降解[11]等;物理降解法,如:輻照降解[12]、微波降解[13]等;菌解法[14]或酶法降解[15],酶法降解具有底物專一性強、反應條件溫和、反應過程易于控制等優(yōu)點,具有更強的應用優(yōu)勢[16]。本文利用產κ-卡拉膠酶的食鹿角菜假交替單胞菌(Pseudoalteromonascarrageenovora)ASY5發(fā)酵獲得κ-卡拉膠酶,利用κ-卡拉膠酶酶解κ-卡拉膠,通過控制反應條件,改進κ-卡拉膠寡糖的制備工藝并對其進行定性分析從而實現快速、高效地制備不同平均聚合度的κ-卡拉膠寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卡拉膠 綠新(福建)食品有限公司;半乳糖、硫酸、鹽酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、三羥基氨基甲烷(Tris) 中國醫(yī)藥集團上海試劑公司。

UV-2600A型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TD5M-WS臺式離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;pH211C酸度計 北京哈納科儀科技有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;20L酶反應罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 卡拉膠粗酶液的制備 卡拉膠粗酶液:由實驗室能產卡拉膠酶的食鹿角菜假交替單胞菌(Pseudoalteromonascarrageenovora)ASY5菌株發(fā)酵制備。取卡拉膠降解菌純培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,20 ℃振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液9800×g離心10 min,取上清作為粗酶液。

1.2.2 單因素實驗 稱取一定質量的卡拉膠溶于pH7.0的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)中,配制成8 g/L的卡拉膠溶液,從中取18 mL溶液,加入2 mL酶活為3.0 U/mL的粗酶液(以加入2 mL滅活酶液做空白對照),在一定溫度下水解反應60 min,每10 min取1 mL酶解液,立即沸水浴10 min滅酶活終止反應,測定還原糖含量,并計算反應過程中平均聚合度的變化。在酶解液pH7.0、反應溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同底物濃度(4、6、8、10、12、14 g/L)在卡拉膠酶水解過程中對還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、反應溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同酶解液pH(6.5、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)在卡拉膠酶水解過程中對還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、pH7.0、振蕩速率100 r/min的條件下,考察不同反應溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)在卡拉膠酶水解過程中對還原糖生成量的影響;在底物濃度12 g/L、pH7.0、反應溫度40 ℃的條件下,考察不同振蕩速率(0、80、100、140、160 r/min)在卡拉膠酶水解過程中對還原糖生成量的影響。進行單因素實驗,考察各因素對κ-卡拉膠寡糖生成量的影響。

1.2.3 卡拉膠酶水解卡拉膠動力學實驗 分別配制底物濃度為4～14 g/L的卡拉膠溶液,以卡拉膠溶液為底物,卡拉膠酶為催化劑,在最優(yōu)反應條件下進行水解反應。從加入酶液開始計時每2 min取樣一次,立即于100 ℃水浴10 min滅酶活終止反應。按照標準曲線的方法測定水解液中還原糖的生成量。運用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法求出Km值和Vmax值[17]。

1.3 檢測方法

1.3.1 卡拉膠酶活力的測定 參考文獻[18]的方法,取0.05 mL酶液加入到0.45 mL 0.5%卡拉膠溶液(0.05 g卡拉膠溶于10 mL濃度0.05 mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液)中,60 ℃反應20 min,100 ℃滅酶活10 min終止反應,采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖生成量。以滅活的酶液作為空白對照。在本實驗條件下,每分鐘催化產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.3.2 還原糖含量和總糖含量測定 采用DNS法測還原糖含量[17]。精確稱取葡萄糖0.1 g放入100 mL容量瓶中配制成0.1 mg/mL標準摩爾濃度溶液,分別吸取0.0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL置于具塞試管中,每組做三個平行,加DNS溶液混勻后于100 ℃顯色5 min,冷卻后加蒸餾水補足體積至5 mL,于波長520 nm處測吸光度值。以標準糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。根據標準曲線計算得到卡拉膠還原糖含量。

采用苯酚-硫酸法測總糖含量[19]。配制0.1 mg/mL半乳糖溶液,分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞試管中,并加入蒸餾水保持每支試管體積相同。然后加入6%苯酚0.5 mL,混勻后快速加入濃硫酸2.5 mL,混勻,室溫條件下靜置30 min,每組做三個平行,于波長590 nm處測吸光度。以標準糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。根據標準曲線計算即可得到卡拉膠總糖含量。

1.3.3 平均聚合度測定 平均聚合度=總糖含量/還原糖含量[20]。

1.3.4 卡拉膠降解產物的組成和結構分析 薄層層析(TLC)分析[20]:硅膠板于110 ℃活化1 h,將寡糖樣品進行毛細管點樣,展開劑為:正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶2∶1,顯色劑:濃度為10%(v/v)的乙醇-硫酸溶液。

質譜(ESI-MS)分析[21]:寡糖樣品采用以電噴霧作離子源的質譜儀在負離子模式下測定寡糖的相對分子質量,1.0 mg/mL樣品溶于1∶1的乙腈/水,經LC注射環(huán)直接進樣5 μL,用Maslynk 4. 0軟件采集和處理數據。

1.4 數據統(tǒng)計分析

實驗結果均以3次平行測定的均值表示,數據使用軟件SPSS 17.0進行顯著性差異分析。

2 結果與討論

2.1 底物濃度對酶解過程的影響

分別測定不同底物濃度、不同時間下還原糖的生成量,考察卡拉膠酶水解過程中還原糖生成量的變化,結果如圖1所示。

圖1 底物濃度對卡拉膠酶解過程的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of carrageenan

由圖1可以看出當底物濃度小于12 g/L時,還原糖的生成量以及反應速度隨著底物濃度的增加逐漸增大。這是因為在酶濃度一定的情況下,當底物濃度較低時,酶能夠充分飽和地與底物接觸反應,隨著底物濃度的增加,酶與底物的接觸面積越來越大,反應速度也越來越快,水解產物的生成量也越來越大,但由于受到底物濃度的限制,反應產物的生成量達到一定量后不再增加。但當底物濃度達到一定程度時酶與底物的接觸達到飽和,沒有多余的酶參與催化反應,因此反應速度不再增加。另一方面,由于卡拉膠溶液存在一定的粘度,阻礙了酶與底物的接觸,尤其是在高濃度條件下,酶不易均勻擴散到溶液中,從而降低反應速度,延緩了酶解反應達到平衡的時間。因此,當底物濃度為14 g/L時與底物濃度為12 g/L時相比,還原糖的生成量相當且不再顯著增加,即12 g/L為卡拉膠酶解反應的最佳底物濃度。

2.2 pH對酶解過程的影響

溶液pH對酶解效果的影響較大,一般只有在最適pH條件下酶才表現出最強催化效率,過酸或過堿條件下,酶解效果會有所降低,甚至使酶失活。另一方面,卡拉膠的穩(wěn)定性對酶解反應會存在影響,由于卡拉膠在酸性條件下不穩(wěn)定容易發(fā)生降解,而在中性和堿性條件下較穩(wěn)定,在pH為9時穩(wěn)定性最好[18,23]。按照1.3.2的實驗方法,分別測定不同pH條件下卡拉膠酶解反應的還原糖生成量,實驗結果如圖2所示。

圖2 pH對卡拉膠酶解反應過程的影響Fig.2 Effect of pH on the hydrolysis of carrageenan

由圖2可知,當pH為9.0時還原糖的生成量、反應速率達到最大,反應達到平衡的時間最短,因此確定pH9.0為卡拉膠酶的最適pH。在酸性條件下,還原糖的生成量明顯低于堿性條件,即卡拉膠酶在堿性條件下的酶解效果要明顯強于酸性條件下的酶解效果。根據pH6.5條件下還原糖生成量的變化趨勢,推測在酸性條件下卡拉膠酶活力可能受到抑制。

2.3 溫度對酶解過程的影響

溫度一方面可以影響酶的催化特性,另一方面影響溶液的流變特性,從而影響酶解效果。在一定溫度范圍內,酶催化速率隨溫度的升高而升高,當溫度升高到一定范圍時,酶蛋白發(fā)生變性,減少有效酶量,導致降低酶促反應速率,因此一般酶解反應條件比較溫和。隨著溫度的升高,增加溶液中各成分的熱能,底物分子和酶運動加快,增加了兩者的接觸機會,改變反應平衡常數,從而改變底物的生成量。

在不改變其他條件的情況下,在不同溫度下酶解反應還原糖的生成量如圖3所示。

圖3 反應溫度對酶解卡拉膠反應過程的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the hydrolysis of carrageenan

由圖3可知,反應溫度為40 ℃時還原糖的生成量達到最大,且反應速率最快,在35～50 ℃在反應后期差異不大。當溫度大于40 ℃時,隨溫度的升高還原糖的生成量逐漸降低,因此確定卡拉膠酶解反應的最適溫度為40 ℃。

對比35 ℃與55 ℃水解曲線,在反應初期酶解反應速率基本相同,隨著反應時間的延長55 ℃條件下還原糖的生成量基本不再增加,由此反映出溫度相對較高的55 ℃條件下,酶逐漸失活。但由于酶蛋白的變性失活需要一定時間才能被表現出來,因此在反應初期酶依然能夠作用于卡拉膠生成部分還原糖。在60 ℃時,反應初期的速率相對較低,進一步說明了卡拉膠酶的高溫不耐受性。

2.4 振蕩速率對酶解過程的影響

在振蕩條件下,可能會增加酶與底物的接觸機會,從而加快反應的進行?？ɡz溶液具有較高的粘度,添加適當的振蕩,對反應過程的傳質、傳熱會產生有利的影響?？疾觳煌袷幩俾氏逻€原糖的生成量,結果如圖4所示。

圖4 振蕩速率對酶解卡拉膠反應過程的影響Fig.4 Effect of oscillation rate on the hydrolysis of carrageenan

由圖4所示,振蕩速率為100 r/min的條件下,還原糖的生成量達到最大,振蕩速率過高或過低均不利于還原糖的生成。由此說明適宜的振蕩環(huán)境有助于酶與底物的充分接觸,使酶促反應的催化效率及底物轉化率更高、更徹底,但對比于其他因素條件(底物濃度、pH、反應溫度)，振蕩速率對還原糖的改變量相對變化不大。

2.5 不同反應溫度和pH條件下的平均聚合度

基于不同反應溫度和不同pH條件下還原糖生成量的較大差異,將這兩種條件下的平均聚合度進行對比。結果如圖5所示。

圖5 不同反應溫度(A)和不同pH(B)條件下的平均聚合度變化曲線Fig.5 Average polymerization degrees of reaction products under different temperature(A)and different pH(B)conditions

圖5A中隨著反應時間的進行,在35～50 ℃范圍的平均聚合度的變化差異基本不大,不同溫度下平均聚合度范圍為7～14。由圖5B可明顯觀察到隨著反應時間的進行,不同pH條件下平均聚合度變化差異較大,平均聚合度變化范圍為7～45,因此可主要通過改變pH控制反應條件制得不同平均聚合度的卡拉膠寡糖。

2.6 酶促反應動力學結果及分析

根據上述實驗結果在pH9.0,反應溫度40 ℃,振蕩速率100 r/min條件下,分別測得不同底物濃度下的反應初速度,以1/[S]為橫坐標,1/[V]為縱坐標繪制底物濃度與反應初速度的Lineweaver-Burk雙倒數擬合曲線,結果如圖6所示:

圖6 底物濃度與反應初速度的Lineweaver-Burk雙倒數擬合曲線Fig.6 Fit curve of Lineweaver-Burk plot between initial reaction rate and substrate concentration

由圖6可知在最適反應條件下底物濃度與反應初速度的Lineweaver-Burk雙倒數擬合方程為:y=185.99x+1.0816,得卡拉膠酶的Km值為171.96 mg/mL,最大反應速度Vmax為0.925 mg·mL-1·min-1。

2.7 最優(yōu)工藝驗證實驗及20 L放大實驗

在最佳酶解工藝條件下酶解反應60 min,進行驗證實驗,并按照上述條件進行20 L放大實驗,結果如圖7所示:

圖7 最優(yōu)工藝驗證實驗(A)與20 L放大實驗(B)水解曲線Fig.7 Verification test of optimum technology(A) and enlarging experiment of 20 L scale(B)

由圖7可知,隨著反應時間的延長,還原糖的含量逐漸增加,并在20 min基本達到平衡。最優(yōu)工藝驗證實驗和放大實驗結果趨勢一致。

2.8 水解產物的組成與結構分析

2.8.1 薄層層析(TLC)檢測 在最優(yōu)條件下,對不同反應時間下的酶解產物,點樣上清液,采用TLC法進行分析,結果如圖8所示。

圖8 TLC檢測不同時間下卡拉膠酶解反應產物Fig.8 TLC analysis of the products of carrageenan enzymatic hydrolysis under different reaction time

根據TLC結果顯示,反應0.5 h時,酶解產物主要為六糖;反應1、2 h可觀察到有四糖、六糖生成;在反應6 h時除了四糖、六糖還可觀察到有二糖產生;在反應12、24 h時,產物主要為二糖、部分為四糖。由此說明在最優(yōu)條件下短時間(0.5～2 h)內,酶解反應的主要產物為四糖和六糖。隨著反應時間的延長,反應底物逐漸被降解分子量更小的六糖、四糖、二糖,還原糖的生成量也隨之逐漸增加。因此可以根據需要調整酶解反應時間,制備適合的卡拉膠寡糖。

2.8.2 質譜(ESI-MS)分析 根據TLC分析結果,對酶解24 h的產物進行醇沉分級,直接通過MS分析酶解產物分子量。

根據TLC分析結果,對酶解24 h的產物進行醇沉分級,直接通過MS分析酶解產物分子量。由圖9中可看出質譜圖上形成兩個主要的峰,對應的質核比分別為394.0和403.0,結合相關文獻[18]及質譜結果可知質核比394.0、403.0、709.0、789.0分別對應[(An-G4S)]2-、[(An-G4S)]-、[(An-G4S)2]-和[(An-G4S)(An-G)]-,表明酶解主產物為κ-卡拉膠二糖,即均含有1個3,6-內醚-α-D-半乳糖殘基和1個4-硫酸-β-D半乳糖殘基。結合TLC結果與質譜結果共同驗證,酶解反應終產物為卡拉膠二糖。因此可得出隨著水解時間的推移,卡拉膠依次被分解成小分子量的κ-卡拉膠六糖、四糖、二糖,而酶解反應終產物為κ-卡拉膠二糖。

圖9 卡拉膠酶解產物ESI-MS譜圖Fig.9 ESI-MS spectrum of the enzymatic hydrolysis products of carrageenan

3 結論

本研究利用食鹿角菜假交替單胞菌ASY5發(fā)酵生產κ-卡拉膠酶酶解κ-卡拉膠制備κ-卡拉膠寡糖,通過單因素實驗確定了較佳反應條件為:底物濃度12 g/L、pH9.0、反應溫度40 ℃、振蕩速率100 r/min。在該條件下還原糖生成量可達1.61 mg/mL,在不同pH條件下可制得平均聚合度范圍為7～45的卡拉膠寡糖。結合TLC和質譜方法對κ-卡拉膠寡糖的組成和結構分析,結果表明酶解反應終產物為κ-卡拉膠二糖。相對于傳統(tǒng)酶解卡拉膠制備卡拉膠寡糖的方法,本研究為改進κ-卡拉膠寡糖的制備工藝從而提高卡拉膠寡糖的得率提供了實驗依據。

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Technology optimization for enzymatic preparation of κ-carrageenan oligosaccharides

ZHANG Xue-fang1,YU Qian1,WU Chang-zheng1,2,3,4, XIAO Qiong1,2,3,4,ZHU Yan-bing1,2,3,4,XIAO An-feng1,2,3,4,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China; 2.Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering of Fujian Province,Xiamen 361021,China; 3.Fujian Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China; 4. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China)

In this study,κ-carrageenan oligosaccharides were prepared by enzymatic hyrolysis method to improve the technology. Hydrolysis conditions were optimized with the characteristic signs of reducing sugars content,and the optimal conditions for κ-carrageenan oligosaccharides preparation were obtained as substrate concentration 12 g/L,pH7.0,reaction temperature 40 ℃ and shaking speed 100 r/min,respectively. Compared with the reducing sugars yield of the initial conditions,the yield of the optimal conditions increased from 0.91 mg/mL to 1.61 mg/mL,which was increased by 77%. The Kmand Vmaxvalues of the enzyme hydrolysis reaction was 171.96 mg/mL and 0.925 mg·mL-1·min-1,respectively. Then,the result of optimal process validation test could consistent with that of 20 L enlarge experiment. At last,the enzymatic hydrolysis products were analyzed by thin-layer chromatography and mass spectrometry,the result showed that the main products included tetrasaccharide and hexasaccharides in 24 h reaction.

carrageenan;carrageenan oligosaccharides,;enzymolysis

2016-07-28

張雪芳(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：1546095135@qq.com。

*通訊作者:肖安風(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：xxaaffeng@jmu.edu.cn。

福建省高校產學合作項目(2016N5008)；福建省科技重大專項/專題(2015NZ0001-1)；福建省海洋高新產業(yè)發(fā)展專項項目(閩海洋高新[2016]08號)；國家海洋公益行業(yè)科研專項(201505033)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0171-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.025