嚴(yán)美婷,董開發(fā),曲旭龍,陳衛(wèi)平,張超鳳,張鳳英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045)

日常用膠帶和標(biāo)簽紙上溶血細(xì)菌的分離鑒定

嚴(yán)美婷,董開發(fā),曲旭龍,陳衛(wèi)平,張超鳳,張鳳英*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045)

評(píng)估生活中日常用膠帶和標(biāo)簽紙的安全風(fēng)險(xiǎn)性,并對(duì)各樣本上的溶血細(xì)菌進(jìn)行分離及鑒定。采集日常生活中經(jīng)常用到的膠帶、標(biāo)簽紙,無菌操作剪取一小塊貼于血平板上置于35～37 ℃培養(yǎng),用作業(yè)本、打印紙、新聞紙等常用紙張做對(duì)照,24～48 h后通過觀察溶血圈的大小來判斷各種樣本上微生物的溶血性的強(qiáng)弱,據(jù)此評(píng)估該樣本的安全風(fēng)險(xiǎn)性;對(duì)各種樣本上微生物菌落進(jìn)行分離純化,再通過革蘭氏染色、觀察細(xì)胞形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行菌屬鑒定。結(jié)果表明,所測(cè)定的樣本上的溶血菌均為芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),且菌來源于樣本的膠質(zhì)層。日常用的各種膠帶、標(biāo)簽紙都存在一定的潛在的微生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

溶血性,膠帶,標(biāo)簽紙,鑒定,解淀粉芽孢桿菌

膠帶、標(biāo)簽紙及兒童貼紙等在日常生活中應(yīng)用廣泛,然而這些產(chǎn)品均存在一定的潛在的微生物安全風(fēng)險(xiǎn),將微生物實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)簽紙直接貼于血平板上,其中培養(yǎng)基上標(biāo)記著不同的金黃色葡萄球菌株,經(jīng)培養(yǎng)了1 d后觀察發(fā)現(xiàn):幾株金黃色葡萄球菌株均未出現(xiàn)溶血圈,而在標(biāo)簽紙的周圍卻有明顯溶血圈。因此筆者采集了日常生活中經(jīng)常用到的各種膠帶(包括超市捆綁蔬菜的膠帶)、標(biāo)簽紙、個(gè)性貼紙做溶血菌微生物調(diào)查,并用作業(yè)本、打印紙、新聞紙等常用紙張做對(duì)照,評(píng)估這類產(chǎn)品的潛在微生物安全風(fēng)險(xiǎn)性。再對(duì)各種樣本上溶血菌落進(jìn)行分離純化,通過革蘭氏染色、測(cè)定細(xì)胞大小、嗜鹽性實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行菌屬鑒定。以此可為評(píng)估膠帶、標(biāo)簽紙等產(chǎn)品是否存在潛在的微生物安全風(fēng)險(xiǎn)性提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

透明膠(寬度為1.0、4.0 cm)、雙面膠(寬度為1.0、1.5、2.0 cm)、捆扎蔬菜膠帶(寬度為1.0、2.0 cm)、標(biāo)簽紙(寬度為1.0、2.5 cm)各一卷、兒童貼紙(海綿寶寶和動(dòng)物頭像)各一頁 超市購(gòu)買或采集;作業(yè)本、打印紙、新聞紙、信封牛皮紙、衛(wèi)生紙、課本、透明包裝塑料紙 筆者辦公室搜集；哥倫比亞血瓊脂平板、桿菌肽紙片 上?？片敿尉S生物技術(shù)有限公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、肌醇、甘露醇、木糖、果糖 生化試劑;氯化鈉 分析純。

HH-BLL-600電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠;AR214電子天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備有限公司;XSP-103B生物顯微鏡 寧波永新光學(xué)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各種培養(yǎng)基的制備 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏0.5 g,蛋白胨1 g,氯化鈉0.5 g,瓊脂2 g,蒸餾水100 mL,pH7.0～7.5。

土豆培養(yǎng)基的制備:馬鈴薯20 g,葡萄糖2 g,瓊脂1.5～2 g,水100 mL,馬鈴薯去皮切片,煮20 min后取汁,加葡萄糖、瓊脂、水溶解分裝滅菌。

1.2.2 樣本溶血性細(xì)菌的檢測(cè) 在無菌操作條件下將樣本的外層表面和側(cè)邊緣用75%的乙醇消毒,然后剪成長(zhǎng)1 cm,寬0.5 cm的長(zhǎng)方形貼在血平板上,每個(gè)血平板貼三到四小塊均勻分開,蓋好蓋,放入培養(yǎng)箱35～37 ℃培養(yǎng)1～4 d,觀察樣本周圍是否有溶血圈,溶血圈越大,說明菌多或菌的溶血性較強(qiáng)。

1.2.3 分離純化 先劃線分離,再稀釋分離。

1.2.4 革蘭氏染色 涂片、固定→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢。

1.2.5 菌體大小 用顯微鏡和顯微測(cè)微尺測(cè)定。

1.2.6 嗜鹽性實(shí)驗(yàn) 將溶血菌接入含NaCl 6.5%的營(yíng)養(yǎng)肉湯試管里恒溫培養(yǎng)1～2 d,觀察菌是否能生長(zhǎng)。

1.2.7 菌株運(yùn)動(dòng)性檢測(cè) 用接種針挑取待檢菌體垂直穿刺接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基,至距管底3～5 mm為止,從原路退回,放在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如果菌體沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng),則菌株具有運(yùn)動(dòng)能力。

1.2.8 桿菌肽敏感性實(shí)驗(yàn) 將待檢菌純培養(yǎng)物菌液稀釋至合適濃度均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,以未接種菌液的培養(yǎng)基上作對(duì)照組,然后貼上0.04 U/片的桿菌肽紙片,35 ℃培養(yǎng)18～24 h,觀察紙片周圍是否有抑菌圈。

1.2.9 生理生化實(shí)驗(yàn) 糖分解實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、M-R實(shí)驗(yàn)[1]。

1.2.10 分子生物學(xué)鑒定 將分離純化得到的菌株交由青島科標(biāo)檢測(cè)研究院有限公司進(jìn)行測(cè)序。然后將目標(biāo)序列在NCBI中查找同源序列,進(jìn)行blastn比對(duì),從中選出相似性在99%以上的幾個(gè)序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種膠帶、標(biāo)簽紙、紙張?jiān)谘桨迮囵B(yǎng)現(xiàn)象

2.1.1 各種膠帶溶血菌潛藏狀況 將透明膠(寬度為1.0、4.0 cm)、雙面膠(寬度為1.0、1.5、2.0 cm)、超市蔬菜捆扎膠帶(寬度為1.0、2.0 cm)貼于血平板培養(yǎng),培養(yǎng)24～48 h后,膠帶周圍均長(zhǎng)有灰色的菌苔,菌苔顏色形態(tài)基本一致,菌苔周圍或環(huán)側(cè)有1～10 mm的透明溶血圈。培養(yǎng)48 h后溶血圈明顯變大,血平板顏色變淺,說明菌繁殖越多,溶血能力越強(qiáng)。其中寬度為1.5 cm和2.0 cm雙面膠貼在血平板上培養(yǎng)24 h后雖無明顯溶血圈,但培養(yǎng)48 h后菌落外沿出現(xiàn)了1～2 mm寬度的溶血圈,并且培養(yǎng)72 h 溶血圈直徑繼續(xù)變大,表明該規(guī)格雙面膠初始含菌量較少。因此可知各種規(guī)格透明膠、雙面膠、蔬菜捆扎膠帶上均潛藏溶血細(xì)菌,一遇上合適的條件就會(huì)迅速繁殖。結(jié)果如圖1所示。這提示人們?cè)谑稚掀つw有創(chuàng)口時(shí)最好不要使用或帶手套使用各種膠帶可減少傷口感染化膿的幾率。

圖1 各種膠帶上溶血細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The test result of hemolytic bacteria of all kinds of adhesive tape注:圖片結(jié)果為培養(yǎng)48 h,圖2、圖3同。

2.1.2 標(biāo)簽紙、兒童玩具貼帶菌狀況 將標(biāo)簽紙、兒童玩具貼直接貼于血平板上培養(yǎng)24 h的貼標(biāo)簽紙血平板上有1～2 mm的明顯溶血圈,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)溶血圈直徑也變大,當(dāng)培養(yǎng)48 h后溶血圈超過10 mm,溶血現(xiàn)象明顯,整個(gè)血平板顏色變淡,且菌苔形態(tài)類似上述膠帶的溶血菌,表面無其它菌落生長(zhǎng),現(xiàn)象見圖2。故可判斷標(biāo)簽紙、兒童玩具貼上也存在溶血細(xì)菌。

圖2 標(biāo)簽紙上和玩具貼上溶血細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The test result of hemolytic bacteria of label paper and toys stickers

2.1.3 各種紙張帶菌狀況 有人會(huì)質(zhì)疑膠帶,標(biāo)簽紙,兒童貼上的類似溶血菌有可能是空氣中的,不一定是膠質(zhì)層的,因此本實(shí)驗(yàn)采集了日常用的各種紙張如作業(yè)本、打印紙、衛(wèi)生紙(新、舊衛(wèi)生紙)、報(bào)紙(新、舊報(bào)紙)及透明包裝塑料紙等來做檢測(cè)作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)作業(yè)本、書、A4打印紙、牛皮紙信封、新衛(wèi)生卷紙及透明包裝塑料紙均沒有溶血菌;而新、舊報(bào)紙、舊衛(wèi)生紙有溶血菌,新報(bào)紙、舊衛(wèi)生紙結(jié)果見圖3。

圖3 各種紙張上溶血細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The test result of hemolytic bacteria of all kinds of paper

結(jié)果表明新衛(wèi)生紙沒有溶血菌,而舊衛(wèi)生紙有溶血菌,這是因?yàn)樾l(wèi)生紙是再生紙,一些耐熱菌和芽孢很難殺死,時(shí)間長(zhǎng)了衛(wèi)生紙容易受潮,受潮后芽孢菌易萌發(fā),因此舊衛(wèi)生紙上有溶血菌,危害性較大。由于新聞紙也易吸潮,不能滿足標(biāo)簽紙和玩具貼的功能性,因此一般標(biāo)簽紙和玩具貼是不用報(bào)紙這一類的新聞紙生產(chǎn)的,故我們可得出標(biāo)簽紙和玩具貼上的溶血菌由膠質(zhì)層帶入的可能性較大;貼有透明包裝塑料紙的血平板中沒有出現(xiàn)溶血圈,說明膠帶上的溶血菌也應(yīng)該可能是膠質(zhì)層里的。

2.2 分離純化

將透明膠和雙面膠上具有溶血作用的菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上多次劃線和稀釋分離后培養(yǎng)24 h,發(fā)現(xiàn)所有樣本上的優(yōu)勢(shì)菌株菌落特征均相同,為:米白色、微凸、表面光滑、圓形、不透明。然后將它們?cè)俅谓拥窖桨迳吓囵B(yǎng)24 h,發(fā)現(xiàn)均有明顯的溶血作用,并在血平板上菌落顯灰色,表面粗糙不透明。

將分離純化得到的所有樣本的溶血菌進(jìn)行革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)均為陽性菌,培養(yǎng)8～12 h后菌體呈桿狀,兩端鈍圓,桿狀成對(duì)或單個(gè)排列,24～48 h后菌體呈短桿狀,單個(gè)分布,菌體大小為(1.4～2.1) μm×(0.4～0.5) μm。因此從形態(tài)上可看出,該溶血菌不是溶血性鏈球菌、葡萄球菌和副溶血性弧菌。結(jié)果見圖4。

圖4 菌落形態(tài)和菌體形態(tài)圖Fig.4 Colony morphology and cell morphology

2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)

不同細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng),分解利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力也不同,故導(dǎo)致其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同,即使是在分子生物學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天,細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中依然起著較大作用。

2.3.1 嗜鹽性實(shí)驗(yàn) 將分離純化得到的溶血菌進(jìn)行嗜鹽性實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株生長(zhǎng)良好,溶液渾濁,說明該菌具有耐高鹽的特性。

2.3.2 穿刺實(shí)驗(yàn) 將溶血菌進(jìn)行穿刺接種實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌沿穿刺線呈松散狀擴(kuò)散生長(zhǎng),呈倒立的傘狀,說明該菌株有運(yùn)動(dòng)能力。

2.3.3 桿菌肽敏感性實(shí)驗(yàn) 將溶血菌進(jìn)行桿菌肽敏感性實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接有菌液的培養(yǎng)基上的試紙周邊出現(xiàn)了明顯抑菌圈,而對(duì)照組沒有,現(xiàn)象見圖5,說明該溶血菌對(duì)桿菌肽敏感。

圖5 桿菌肽敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of bacitracin sensitivity

2.3.4 糖發(fā)酵及其它生化實(shí)驗(yàn) 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,從中發(fā)現(xiàn)不同樣本分離到的溶血菌生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,說明它們是同一種屬的細(xì)菌。將菌體的形態(tài)特征和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中溶血菌進(jìn)行比對(duì),可以把溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌[2]、溶血性大腸桿菌[3]、李斯特菌[4-5]逐個(gè)排除。

表1 生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical identification

注:“+”代表結(jié)果為陽性;“-”代表結(jié)果為陰性。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將分離純化得到的溶血菌進(jìn)行基因測(cè)序,并將得到的基因序列通過BLAST進(jìn)行同源序列檢索[6]發(fā)現(xiàn),與該菌株同源性最高的前10個(gè)菌株中有6個(gè)為解淀粉芽孢桿菌,且基因同源性均在99%以上。菌株BacillusamyloliquefaciensAF489591與該菌株差異性最小,同源性水平最高。因此,分離純化得到的溶血菌與BacillusamyloliquefaciensAF489591的親緣關(guān)系最近,結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以鑒定得出該溶血菌菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

目前發(fā)現(xiàn)具有溶血性的菌有溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌、溶血性大腸桿菌、李斯特菌、解淀粉芽孢桿菌[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從透明膠、雙面膠上的溶血細(xì)菌進(jìn)行了分離純化,再經(jīng)過顯微鏡觀察菌體形態(tài)可知該溶血菌不是溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌;經(jīng)嗜鹽性實(shí)驗(yàn)排除溶血性大腸桿菌;經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)確定不是李斯特菌,最終經(jīng)分子生物學(xué)鑒定確定該溶血菌為解淀粉芽孢桿菌。

雖然過去有不少資料把解淀粉芽孢桿菌作為一種提取抑菌劑或發(fā)酵保鮮液的有益細(xì)菌來研究開發(fā)[8-9],并在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有所應(yīng)用,被認(rèn)為是無毒素和無致病性。但近年來也有報(bào)道稱該菌會(huì)污染空氣和食品,造成特殊人群皮膚破損或免疫力低下人群的感染,其“無毒”和“無致病性”已經(jīng)受到質(zhì)疑[10-11],相關(guān)研究認(rèn)為,此菌為條件致病菌[12-13]。該菌可污染醫(yī)院75%酒精消毒液[14-15]、潮濕損害的房屋、食品,造成新生兒、嬰幼兒等免疫力低下的特殊人群感染健康綜合征[15-16]。這些危害與本文實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論——日常用的各種膠帶、標(biāo)簽紙都存在一定的潛在的微生物安全風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)應(yīng)。

結(jié)合本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,日常用的手機(jī)貼、水果標(biāo)簽貼、兒童玩具貼和蔬菜捆綁帶等各種膠帶、標(biāo)簽紙都存在一定的潛在的微生物安全風(fēng)險(xiǎn),它們的膠質(zhì)層里可能帶有解淀粉芽孢桿菌,使用時(shí)易使皮膚破損或免疫力低下者感染致病。因此發(fā)表本文以期引起消費(fèi)者及相關(guān)把解淀粉芽孢桿菌作為有益菌研究的科研工作者和臨床上的重視。

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Isolation and identification of hemolytic bacteria on common adhesive tape and label paper

YAN Mei-ting,DONG Kai-fa,QU Xu-long,CHEN Wei-ping,ZHANG Chao-feng,ZHANG Feng-ying*

(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

To assess the adhesive tape and label paper security risks in daily life,and to separate and identify the hemolytic bacteria of the samples. The adhesive tape and paper label were collected in commonly daily life,and a small piece of the samples were sheared on the blood plate with aseptic technique,cultivated at 35～37 ℃,and the comparisons were workbook,printing paper,newsprint and other commonly used paper. The strength of the microbial hemolytic were judged by observing the size of hemolysis circle of the samples after 24～48 hours cultivating,and the safety risks of the samples were also assessd. The samples were separated and purified on microbial colony,and through the gram stain,observiation of cell morphology,physiological,biochemical test and 16S rDNA sequencing,the species were identificated. Results showed that the hemolytic bacterium of samples for determination isBacillusamyloliquefaciens,and it comes from glial layer of the samples. To some degree,daily adhesive tapes,label papers have potential microbial security risks.

hemolytic;adhesive tape;label paper;identification;Bacillusamyloliquefaciens

2016-10-24

嚴(yán)美婷(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：1303028648@qq.com。

*通訊作者:張鳳英(1964-)，女，本科，研究員，研究方向：食品微生物、食品工程，E-mail：3q3w3q3w@163.com。

TS201.6

A

1002-0306(2017)07-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.046