劉慧琳,陳曉默,吳春玲,劉美林,王 靜

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學,北京 100048)

不同加工條件對模擬體系中晚期糖基化終產(chǎn)物生成的影響

劉慧琳,陳曉默,吳春玲,劉美林,王 靜*

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學,北京 100048)

通過構(gòu)建牛血清蛋白-葡萄糖模擬體系,研究不同加工條件對晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced Glycation End products,AGEs)生成的影響,包括加工時間、溫度、pH、蛋白質(zhì)和葡萄糖濃度對AGEs熒光產(chǎn)物、非熒光產(chǎn)物的影響,以及不同的處理條件下熒光和非熒光產(chǎn)物生成量之間的聯(lián)系。結(jié)果表明,當加熱時間為40 min,加熱溫度為100 ℃,pH為7.0時熒光產(chǎn)物的生成量達到最大值,增加底物濃度在一定程度可以增加熒光產(chǎn)物的量;非熒光產(chǎn)物羧甲基賴氨酸(Nε-(Carboxymethyl)lysine,CML)隨著加熱時間的延長呈現(xiàn)增加的趨勢,當加熱溫度達到110 ℃,pH為堿性時CML的生成量達到最大值。利用SPSS軟件對不同處理條件下熒光產(chǎn)物和非熒光產(chǎn)物生成量的相關(guān)性進行研究,二者隨著加熱時間的變化呈現(xiàn)負相關(guān),隨著其他加工條件的變化并沒有呈現(xiàn)直接相關(guān)性。

晚期糖基化終產(chǎn)物,非熒光產(chǎn)物,羧甲基賴氨酸,生成規(guī)律,加工模型

美拉德反應(yīng)最初是由法國化學家美拉德于1912年將甘氨酸和葡萄糖混合共熱時發(fā)現(xiàn)的,故稱美拉德反應(yīng)。由于產(chǎn)物是棕色的,也被稱為褐變反應(yīng)。美拉德反應(yīng)是食品加熱或貯藏過程中,氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)之間發(fā)生的復雜反應(yīng)。美拉德反應(yīng)可使食品顏色加深并賦予食品一定的風味,但是在美拉德反應(yīng)的后期階段會產(chǎn)生一些對人體有危害的物質(zhì),如類黑精以及晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced Glycation End products,AGEs)等[1]。圖1即為AGEs主要的生成階段圖[2]。AGEs可以分為熒光性交聯(lián)化合物和非熒光性化合物兩大類,前者包括交聯(lián)素、戊糖素等,后者的典型代表是羧甲基賴氨酸(Nε-(Carboxymethyl)lysine,CML)。

圖1 AGEs主要的生成階段圖Fig.1 The mainly generated phase diagram of AGEs

食源性AGEs主要產(chǎn)生于食品加工的過程中,與食品的營養(yǎng)成分有著很大的關(guān)系,高蛋白高脂肪類的食品例如肉類食品,高碳水化合物高油脂食品如餅干和面包等食品在加工過程中會產(chǎn)生相對較多的AGEs[3]。此外,AGEs的生成與不同的食品加工工藝也有著很大的關(guān)聯(lián),如,食品在蒸煮、油煎、油炸、烘烤、焙燒等高溫的加工條件下能夠產(chǎn)生更多的AGEs[4]。大量的動物實驗和臨床實驗表明,AGEs在體內(nèi)大量積累可誘導糖尿病、腎病(尿毒癥)、動脈粥樣硬化,衰老和阿茲海默癥等疾病的發(fā)生[5-8],嚴重危害人體健康。本文建立了牛血清蛋白-葡萄糖加工模型,通過改變時間、溫度、pH、蛋白質(zhì)濃度、葡萄糖濃度來研究AGEs熒光產(chǎn)物、非熒光產(chǎn)物含量的變化規(guī)律以及對不同條件下熒光產(chǎn)物和非熒光產(chǎn)物二者之間存在的相互關(guān)系進行分析,為食品加工過程中通過控制加工條件來達到降低AGEs的含量提供理論基礎(chǔ),對食品食用安全提供了保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清蛋白、葡萄糖、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、硼氫化鈉、三氯乙酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;丙酮、無水乙醇、鹽酸、硼酸、氨水、硼酸鈉、氫氧化鈉 分析純,北京化工廠;乙腈、三氟乙酸 色譜純,北京百靈威科技有限公司。

3K15高速冷凍離心機 德國 SIGMA Laborzentrifugen GmbH;BioTek Synergy H1MDG多功能酶標儀 美國BioTekInstruments,Inc.;UGC-24M氮吹儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;精密強制對流干燥箱 中豪萊伯科技有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;酒精噴燈 濟南魯盈化工有限公司;KQ-700GVDV多用途恒溫超聲清洗儀 昆山市超聲波清洗器;AL203電子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Starter2000pH計 美國奧豪斯(上海)有限公司;安捷倫1260 infinity液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 食品加工過程模擬體系的建立 取牛血清白蛋白(BSA,10 mg/mL)和葡萄糖(Glucose,500 mmol/L)溶于磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4),加入疊氮化鈉(0.02%)[9],放置冰箱4 ℃保存待用。

1.2.2 AGEs熒光產(chǎn)物的檢測 實驗方法參照房紅娟等[10]的方法,分別固定激發(fā)波長為300,320,340,360,380,400 nm,發(fā)射波長范圍為400～700 nm,尋找最大發(fā)射波長為450 nm,且在380 nm激發(fā)時熒光強大最大。因此,將熱加工牛血清蛋白-葡萄糖模擬體系反應(yīng)混合物在激發(fā)波長設(shè)置為380 nm,發(fā)射波長為450 nm處記錄樣品的熒光值。該讀數(shù)代表模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物的生成量。

1.2.3 AGEs非熒光產(chǎn)物CML的檢測

1.2.3.1 預處理 硼氫化鈉還原:取200 μL的樣品(相當于2 mg蛋白質(zhì)當量)于2 mg的離心管中，再向離心管中加入133.3 μL硼酸鈉緩沖液(0.5 mol/L,pH9.2)，使緩沖液的濃度為0.2 mol/L,然后繼續(xù)向離心管中加入17.54 μL硼氫化鈉溶液(2 mol/L,用0.1 mol/L NaOH配制而成)，使硼氫化鈉溶液的濃度為0.1 mol/L[11]，最后將離心管置于4 ℃下，樣品還原10 h。

蛋白質(zhì)分離(TCA沉淀法):加入60%的三氯乙酸(TCA)獲得最后樣品中的最終TCA濃度為20%[12]。10000 r/min離心分離10 min以沉淀蛋白質(zhì),獲得的蛋白質(zhì)用丙酮洗滌2次(離心沉淀)。

蛋白質(zhì)水解:沉淀的蛋白加入1 mL的6 mol/L鹽酸(HCl)110 ℃下水解24 h[13-14],然后氮氣吹掃進行干燥。

除雜純化:將干燥的蛋白質(zhì)水解物重新溶入2 mL水中,PCX固相萃取柱預活化(依次通過3 mL甲醇和3 mL水)[14]。取復溶的樣品溶液通過預活化了的PCX固相萃取柱,然后分別用3 mL水和3 mL甲醇沖洗,最后目標化合物通過5 mL的甲醇(5%的氨水)洗脫,通過氮氣吹掃干燥,重新溶于2 mL水中,然后通過0.22 μm濾膜過濾待測,所有樣品均做三次平行實驗。

1.2.3.2 HPLC-MS/MS檢測CML的色譜條件 HPLC條件:流動相A為含有0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液[15],B為乙腈(ACN),流速為0.2 mL/min,進樣量10 μL。梯度洗脫條件為0～0.5 min為90% A,0.5～4.0 min為90% A～60% A[11],柱溫為30 ℃,運行時間為25 min。

MS/MS條件:電噴霧離子源正模式;多反應(yīng)監(jiān)控模式(MRM),離子源溫度為300 ℃;毛細管電壓為4 kV;一級質(zhì)譜四級桿溫度為100 ℃、二級質(zhì)譜四級桿溫度為100 ℃;MRM模式的設(shè)置為m/z 205.0→m/z 84.0,m/z 205.0→m/z 130.0[15]。

1.2.4 不同加工時間下食品模擬體系的制備 用磷酸鹽(PB)緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4)溶解BSA和葡萄糖[13,16],并定容至100 mL,使牛血清蛋白濃度為10 mg/mL和葡萄糖濃度為500 mmol/L,分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中,擰緊管蓋。在100 ℃水浴條件下分別加熱10、20、25、30、35、40、60、90、120、150、180、210、240 min,隨后放于冰水浴中冷卻。測定不同時間下模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物和CML的含量變化。

1.2.5 不同溫度下食品模擬體系的制備 用PB緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4)溶解牛血清蛋白和葡萄糖[13,16],并定容至100 mL,使牛血清蛋白濃度為10 mg/mL和葡萄糖濃度為500 mmol/L,分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中,擰緊管蓋。為了模擬低溫和高溫熱加工,分別采用水浴加熱和油浴加熱兩種加熱模式。

取裝有模擬體系的玻璃管,分別在40、60、80、90、100、110、120、140、160、180、200、220 ℃下加熱40 min,然后冰水浴冷卻待測。測定不同溫度下模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物和CML的含量變化。

1.2.6 不同pH下食品模擬體系的制備 將PB緩沖液配制成pH為5.0、6.0、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、9.0的溶液,溶解牛血清蛋白和葡萄糖,并定容至100 mL,使牛血清蛋白濃度為10 mg/mL和葡萄糖濃度為500 mmol/L,分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中,擰緊管蓋,在100 ℃條件下加熱40 min。測定不同pH下模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物和CML的含量變化。

1.2.7 不同底物濃度下食品模擬體系的制備

1.2.7.1 改變牛血清蛋白的濃度下食品模擬體系的制備 用PB緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4)溶解牛血清蛋白和葡萄糖,并定容至100 mL,保持葡萄糖的濃度為500 mmol/L,牛血清蛋白的濃度為5、10、20、30、50 mg/mL,分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中,擰緊管蓋,分別在100 ℃下加熱40 min。測定不同條件下AGEs熒光產(chǎn)物及CML的含量變化。

1.2.7.2 改變葡萄糖的濃度下食品模擬體系的制備 PB緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4)溶解牛血清蛋白和葡萄糖,并定容至100 mL,保持牛血清蛋白的濃度為10 mg/mL,葡萄糖的濃度為100、200、500、800、1000 mmol/L,分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中,擰緊管蓋,分別在100 ℃下加熱40 min。測定不同條件下AGEs熒光產(chǎn)物及CML的含量變化。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用SPSSv19.0軟件進行相關(guān)性和顯著性分析,所有樣品進行三次測定(n=3),標準偏差用±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工時間對AGEs生成的影響

AGEs中熒光產(chǎn)物隨著加工時間變化的結(jié)果如圖2所示,加工時間達到40 min之前,熱加工模擬體系中熒光產(chǎn)物隨著加工時間的增加而增加,在加熱40 min時,熒光產(chǎn)物的量達到了峰值,然后隨著加工時間的繼續(xù)增加,熒光產(chǎn)物的量開始減少,與房等的結(jié)果基本一致[10]。可能是因為隨著溫度升高AGEs會進一步生成不具有熒光性的類黑精,導致模擬體系中熒光值的下降[17]。熱加工模擬體系中非熒光產(chǎn)物CML的生成量的變化如圖3所示,在熱加工時間240 min以內(nèi),隨著時間的增加,CML的生成量在不斷的增加,并且熱加工時間在40 min內(nèi),CML的增加速率較慢,而在40 min到240 min之間,生成速率增加。

圖2 加熱時間對熒光產(chǎn)物形成的影響Fig.2 Effect of heating time on the formation of fluorescent products注：圖中不同字母表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異(p<0.05),圖3～圖11同。

圖3 加熱時間對CML形成的影響Fig.3 Effect of heating time on the formation of CML

通過SPSS軟件分析可知,本研究中熒光產(chǎn)物與CML的含量隨著時間的變化趨勢之間呈現(xiàn)出負相關(guān)的關(guān)系(r=-0.712,p<0.01),表明熒光產(chǎn)物的生成量和CML的生成量是有關(guān)聯(lián)的。目前有關(guān)CML可能的生成途徑主要集中在兩方面,一方面是葡萄糖和賴氨酸脫水直接生成席夫堿,然后經(jīng)由席夫堿生成乙二醛,最終和賴氨酸生成CML[16],另一方面是葡萄糖自氧化或者席夫堿經(jīng)過Amadori重排生成果糖基賴氨酸,而果糖基賴氨酸經(jīng)氧化生成CML[18]。而從本研究的結(jié)果熒光產(chǎn)物和CML的生成規(guī)律來看,CML的活性前體也有可能來自于AGEs中其他熒光產(chǎn)物,加熱40 min之后熒光產(chǎn)物一方面生成類黑素導致模擬體系的顏色加深,一方面轉(zhuǎn)化成CML導致CML的含量增加。。

2.2 不同加工溫度對AGEs生成的影響

熒光產(chǎn)物隨加工溫度變化的結(jié)果如圖4所示,溫度低于80 ℃時,AGEs中熒光產(chǎn)物增加緩慢,而溫度高于80 ℃時,熒光產(chǎn)物的量增加迅速,并隨著溫度繼續(xù)升高繼續(xù)增加,在溫度達到100 ℃時達到最大量,然后隨著溫度繼續(xù)增加底物開始生成不具有熒光性的物質(zhì)(如類黑素)[10]則開始減少。當溫度高于140 ℃時,熒光產(chǎn)物量的變化整體呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢,這與高溫下熒光產(chǎn)物的裂解以及與蛋白質(zhì)再交聯(lián)有關(guān)。圖5中檢測結(jié)果顯示,當溫度小于80 ℃時,模擬體系非熒光產(chǎn)物CML的量緩慢增加,而當溫度超過80 ℃時,CML量則呈現(xiàn)出迅速增加的趨勢,當溫度達到110 ℃時,CML的量達到峰值,隨著溫度的繼續(xù)增加,則呈現(xiàn)出下降的趨勢,Nguyen等研究也證明了葡萄糖/乳糖+酪蛋白模擬體系在加熱條件為120、130 ℃時CML存在熱不穩(wěn)定性[19]。結(jié)合圖4和圖5發(fā)現(xiàn),140 ℃之后CML的含量急劇降低而熒光產(chǎn)物的含量卻有所回升,也可能是因為CML和熒光產(chǎn)物之間存在相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系,這與改變加熱時間得到的結(jié)論相同,由此可以看出,適當?shù)慕档蜏囟葘τ谑称分蠥GEs的控制可以起到不錯的效果,這也是現(xiàn)在提倡低溫油炸來加工食品的方式越來越多的受到重視的原因之一。

圖4 加熱時間對熒光產(chǎn)物形成的影響Fig.4 Effect of temperature on the formation of fluorescent products

圖5 加熱溫度對CML形成的影響Fig.5 Effect of temperature on the formation of CML

2.3 不同加工pH對AGEs生成的影響

熒光產(chǎn)物的量隨pH變化如圖6所示,pH從偏酸性增加到中性的過程中熒光產(chǎn)物不斷增加,在pH7.0時達到最大,而隨著溫度的進一步增加則呈現(xiàn)出減少的趨勢,而這個結(jié)果與其他學者研究的結(jié)果相似[10],圖7中的檢測結(jié)果顯示,CML隨著pH不斷變化的規(guī)律和熒光產(chǎn)物有所不同,沒有呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢,而是隨著pH的不斷增加逐漸出現(xiàn)趨于平衡的趨勢。

圖6 加工pH對熒光產(chǎn)物形成的影響Fig.6 Effect of pH on the formation of fluorescent products

圖7 加工pH對CML形成的影響Fig.7 Effect of pH on the formation of CML

從熒光產(chǎn)物的變化規(guī)律和CML的變化規(guī)律可以看出,酸性條件不利于AGEs的生成,而微堿性環(huán)境有利于熒光產(chǎn)物的生成,過堿性環(huán)境不利于熒光產(chǎn)物的生成而對CML的生成影響不大。Nagai等研究也表明,堿性條件下,Amdori化合物轉(zhuǎn)變成CML,而導致熒光性產(chǎn)物隨pH的增大而減少[20]。Matiacevich等提出在低pH條件下,模擬體系更有利于類黑精的生成,因而熒光產(chǎn)物的量較少[17]。因此,在食品加工過程中,適當?shù)慕档图庸H有利于抑制食品中AGEs的產(chǎn)生。

2.4 不同底物濃度對食品加工過程中AGEs生成的影響

圖8 牛血清白蛋白濃度對熒光產(chǎn)物形成的影響Fig.8 Effect of concentration of BSA on the formation of fluorescent products注：葡萄糖濃度為500 mmol/L，圖10同。

葡萄糖濃度為500 mmol/L,不斷變化牛血清蛋白濃度時熒光物質(zhì)的變化規(guī)律如圖8所示。當牛血清蛋白濃度大于20 mg/mL時,熒光物質(zhì)的量增加速度開始降低,有趨于平衡的趨勢。葡萄糖濃度不變?yōu)?00 mmol/L,牛血清蛋白濃度變化時CML的生成規(guī)律如圖10所示,當濃度大于30 mg/mL后,CML的濃度有逐漸趨于平衡的趨勢,說明存在底物飽和的現(xiàn)象。

圖9 葡萄糖濃度對熒光產(chǎn)物形成的影響Fig.9 Effect of concentration of Glu on the formation of fluorescent products注：牛血清蛋白的濃度為10 mg/mL。

圖10 牛血清白蛋白濃度對CML形成的影響Fig.10 Effect of concentration of BSA on the formation of CML注：葡萄糖濃度為500 mmol/L。

圖11 葡萄糖濃度對CML形成的影響Fig.11 Effect of concentration of Glu on the formation of CML注：牛血清蛋白濃度為10 mg/mL。

牛血清蛋白不變,不斷變化葡萄糖濃度時熒光物質(zhì)的變化規(guī)律如圖9所示。當牛血清蛋白濃度保持在10 mg/mL不變時,葡萄糖濃度大于800 mmol/L時,隨著葡萄糖濃度繼續(xù)增大,熒光產(chǎn)物有達到平衡的趨勢。牛血清蛋白濃度不變?yōu)?0 mg/mL,葡萄糖濃度變化時CML的生成規(guī)律如圖11所示,當葡萄糖濃度大于800 mmol/L時,隨著葡萄糖濃度的增加,CML的生成濃度有趨于平衡的趨勢。這與熒光產(chǎn)物隨著底物濃度變化的生成規(guī)律相似。

從熒光產(chǎn)物和CML隨葡萄糖和牛血清蛋白濃度的變化而變化的趨勢可知,食品加工過程中營養(yǎng)成分的含量對于AGEs的形成影響很大,可以在蛋白為主要原料的食品需要高溫加工時適當減少碳水化合物的含量,而在以碳水化合物為原料需要高溫加工的食品可以適當減少蛋白質(zhì)或者油脂的含量,以此來控制AGEs在食品加工過程中的產(chǎn)生量。

3 結(jié)論

食品加工模型牛血清蛋白-葡萄糖體系所產(chǎn)生的AGEs熒光產(chǎn)物和非熒光產(chǎn)物(CML)分別使用熒光光譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行了研究。不同加工條件對模型中AGEs熒光產(chǎn)物和CML的生成具有重要的影響,通過研究模型中AGEs的生成規(guī)律,為其進一步擴大到真實食品體系,進而通過改變加工條件來控制AGEs的產(chǎn)生,最大程度的降低AGEs的含量提供理論支持。

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Effects of different processes on the formation of Advanced Glycation End products in the model system

LIU Hui-lin,CHEN Xiao-mo,WU Chun-ling,LIU Mei-lin,WANG Jing*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

This paper researched on the formation of AGEs in different processing conditions,and the effects of processing time,temperature,pH and the concentrations of protein and glucose on the formation of fluorescent and non-fluorescent products,and the connection between them. The results showed that the largest amounts of fluorescent products were formed at 40 min,100 ℃,pH7.0,and increasing the concentration of substrates could increase the amount of fluorescent products to some extent. As for non-fluorescent products of Nε-(Carboxymethyl)lysine(CML),the production of CML was increased with prolonged heating time,and maximum at 110 ℃ and alkaline condition. The connection of fluorescent and non-fluorescent product in different processing conditions by SPSS software analyzed. It showed a negative correlation with the change of processing time,and other conditions did not show a direct correlation.

Advanced Glycation End products;non-fluorescent products;Nε-(Carboxymethyl)lysine;formation rule;processing model

2016-09-13

劉慧琳(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全檢測,E-mail:liuhuilin@btbu.edu.cn。

*通訊作者:王靜(1976-)，女，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：wangjing@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金(31501559,31571940)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)07-0096-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.010