王洪振,馬存強(qiáng),2,任小盈,王 潘,周斌星,3,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院,云南昆明 650201; 2.昆明大樸茶業(yè)有限公司,云南昆明 650224; 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

普洱茶發(fā)酵產(chǎn)茶多糖菌株的篩選與鑒定

王洪振1,馬存強(qiáng)1,2,任小盈1,王 潘1,周斌星1,3,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院,云南昆明 650201; 2.昆明大樸茶業(yè)有限公司,云南昆明 650224; 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

以不同階段的普洱茶發(fā)酵樣為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行真菌的分離純化,將分離純化出的優(yōu)勢(shì)真菌在理想條件下和自然狀態(tài)下分別進(jìn)行茶葉接種發(fā)酵,篩選出產(chǎn)茶多糖的優(yōu)勢(shì)菌。結(jié)果表明,在普洱渥堆發(fā)酵中共分離純化出22株菌株,其中5株菌株在渥堆發(fā)酵的不同階段頻繁檢出,可用于接種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在接種發(fā)酵中,茶多糖均有顯著增加(p<0.05)。其中PEZJ-1菌株提高茶多糖含量最為顯著,在理想條件下和自然狀態(tài)下的接種發(fā)酵中茶多糖含量分別達(dá)到23.57%和27.85%。通過(guò)菌落形態(tài)、分生孢子顯微特征、18S rDNA序列,對(duì)PEZJ-1進(jìn)行鑒定,確定該菌株為Aspergillusniger(GenBank登錄號(hào)為JX863374),屬于曲霉屬。在普洱茶渥堆發(fā)酵中接種外源微生物能顯著提高茶多糖含量,Aspergillusniger能大幅度提高茶多糖含量,為茶多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了微生物菌種。

茶多糖,普洱茶,篩選,鑒定,黑曲霉

茶葉中的糖類物質(zhì)主要包括單糖、寡糖、多糖及少量其它糖類。茶多糖(tea polysaccharides)是一類從茶葉中分離出溶于水的具有生理活性的糖蛋白[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明茶多糖具有降血糖[2-4]、降血脂[5-6]、降血壓[7]等多種保健功效,并對(duì)肺癌細(xì)胞增殖有一定抑制作用[8],是一種具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的天然藥物。

普洱茶是以云南大葉種茶樹(shù)鮮葉[Camelliasinensis(Linn)var.assamica(MastersKitamura)]加工而成的曬青毛茶為原料,采取特定的加工工藝,形成具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[9]。按照加工工藝不同分為普洱茶(生茶)和普洱茶(熟茶)。普洱茶(熟茶)具有減少腰部脂肪堆積[10]、抗菌[11-12]、抗氧化[13]、減少動(dòng)脈粥樣硬化幾率[14]和一定的防癌抗癌作用[15-16]功效。渥堆(固態(tài)發(fā)酵)是普洱茶(熟茶)品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。在普洱茶渥堆過(guò)程中分離鑒定出多種微生物,其中包括真菌[17-18]、細(xì)菌[17]、嗜熱菌[19]等。真菌主要以曲霉菌、酵母菌、青霉菌和根霉菌為主[20],它們對(duì)普洱茶(熟茶)品質(zhì)形成以及物質(zhì)變化起主要作用。

普洱茶多糖是指從普洱茶中分離純化出的茶多糖。郭威等[21-22]研究證實(shí)普洱茶多糖共有TPS1、TPS2、TPS3、TPS4四種組分,含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖8種單糖。在渥堆發(fā)酵過(guò)程中,真菌、細(xì)菌、嗜熱菌的繁殖代謝對(duì)茶多糖的含量、構(gòu)成、分子量大小產(chǎn)生深刻影響。本文以普洱茶渥堆發(fā)酵樣為材料,篩選鑒定出在渥堆發(fā)酵過(guò)程中可顯著增加茶多糖含量的菌株,為未來(lái)開(kāi)發(fā)普洱茶多糖提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶渥堆發(fā)酵樣和云南大葉種曬青毛茶 昆明大樸茶業(yè)有限公司。普洱茶自然渥堆與單一微生物接種渥堆發(fā)酵在昆明大樸茶廠完成。

Labonce-150TH恒溫恒濕培養(yǎng)箱 北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司;Agilent1200型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;JH-752型紫外可見(jiàn)分光亮度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌與傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵處理 無(wú)菌發(fā)酵處理:稱取潮水量為38%的云南大葉種曬青毛茶,高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后,放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(27 ℃,85%)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌發(fā)酵,每隔5 d取樣一次,測(cè)定其含水量,并提取茶多糖。傳統(tǒng)渥堆處理:準(zhǔn)確稱取200 kg云南大葉種曬青毛茶添加適量生活飲用水,使曬青毛茶潮水量維持在38%～45%之間,在自然狀態(tài)下進(jìn)行傳統(tǒng)渥堆,每隔5 d取樣一次,測(cè)定其含水量,提取茶多糖。

1.2.2 普洱茶渥堆過(guò)程中真菌的分離純化 無(wú)菌操作稱取不同渥堆階段茶樣1.000 g,加入9 mL無(wú)菌生理鹽水,并依次稀釋級(jí)數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行基內(nèi)接種,采用稀釋涂布法,每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行、兩次重復(fù),27 ℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后,每日觀察并記錄各個(gè)菌株生長(zhǎng)的顏色、形態(tài)、大小及質(zhì)地的變化。通過(guò)以上的觀察記錄,對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3 單一微生物發(fā)酵樣的制備 稱取20 g曬青毛茶與12.25 mL蒸餾水混合,高溫高壓滅菌后,每培養(yǎng)瓶接種1 mL目標(biāo)菌株的種子液。培養(yǎng)瓶均放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(30 ℃,85%)進(jìn)行茶葉發(fā)酵。每隔5 d取樣一次,測(cè)定其含水量和茶多糖。

1.2.4 單一微生物菌粉的制備和自然條件下單一微生物渥堆發(fā)酵 菌粉的制備:采用200 g大米、20 g葡萄糖、200 mL蒸餾水的常規(guī)真菌種子培養(yǎng)基,分別接種優(yōu)勢(shì)菌的孢子菌懸液,在恒溫恒濕培養(yǎng)箱(27 ℃,85%)內(nèi)培養(yǎng)至菌落成熟后,在55 ℃恒溫下干燥,在無(wú)菌條件下于研磨成粉狀。自然條件下單一微生物接種渥堆發(fā)酵:設(shè)置相同潮水量的50 kg曬青毛茶發(fā)酵堆,在紫外線輻射滅菌處理后,分別接種0.1%的優(yōu)勢(shì)菌菌粉,在自然條件下進(jìn)行渥堆發(fā)酵,每隔5 d取樣一次。

1.2.5 化學(xué)成分測(cè)定 水分測(cè)定采取GBT 8304-2013中120 ℃烘干法(快速法)測(cè)定。

茶多糖提取與測(cè)定[22]粉碎(過(guò)40目篩)→稱樣→加蒸餾水→浸提→過(guò)濾→濃縮→乙醇沉淀→靜置→離心(4000 r/min)→無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚重復(fù)洗滌三次→干燥→茶多糖成品。茶多糖含量采取苯酚-硫酸法比色測(cè)定[23]。

1.2.6 優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定 菌落及菌株形態(tài)觀察:無(wú)菌操作接種在PDA和察氏培養(yǎng)基上7 d后觀察菌落形態(tài)。并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。分子鑒定方法如下:

DNA提取:目標(biāo)菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基以及察氏固態(tài)培養(yǎng)基,27 ℃培養(yǎng)觀察菌落生長(zhǎng)狀況,并在高倍顯微鏡觀察菌株形態(tài)特征。并將目標(biāo)菌株接種至察氏(CYA)液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)、收集菌絲體、-80 ℃冷凍干燥后采取真菌DNA提取試劑盒法提取DNA。

PCR擴(kuò)增:ITS序列通過(guò)引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min;共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.程序結(jié)束后進(jìn)入10 ℃狀態(tài)。

rDNA序列分析:對(duì)PCR產(chǎn)物通過(guò)DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,并將所獲序列提交到NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索,并調(diào)出相關(guān)菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列,用ClustalX1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì),通過(guò)MEGA4軟件選用Kimura2-parameter距離模型計(jì)算進(jìn)化距離,用Nerghbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),1000次隨機(jī)抽樣計(jì)算Bootstrap值以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育的置信度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件。數(shù)值表示為平均值±S.D.并通過(guò)單因素方法(one-way ANOVA)分析不同樣品之間差異的顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌發(fā)酵與傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵茶多糖含量的變化

在普洱茶(熟茶)發(fā)酵渥堆中,微生物對(duì)茶多酚、茶色素、氨基酸、游離總糖[17]均有顯著影響。本文以云南大葉種曬青毛茶為原料,分別進(jìn)行的無(wú)菌處理和傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵,并測(cè)定不同發(fā)酵階段茶樣中茶多糖含量(圖1)。在無(wú)菌發(fā)酵中,茶多糖含量基本穩(wěn)定在9.13%～11.22%之間。在普洱茶傳統(tǒng)的渥堆發(fā)酵中,茶多糖呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì);在發(fā)酵第10 d,含量達(dá)到最大,與原料相比,茶多糖增加了67%左右。通過(guò)無(wú)菌處理作為對(duì)照,可知在普洱茶渥堆發(fā)酵中,微生物可顯著提高茶多糖含量。研究人員[24]在普洱茶渥堆過(guò)程中共分離出40余種真菌,分屬于19個(gè)不同的屬,其中曲霉屬、青霉屬、酵母菌屬占普洱茶菌落的80%左右[25]。在普洱茶渥堆發(fā)酵中可顯著提高茶多糖含量的優(yōu)勢(shì)菌值得進(jìn)一步研究。

圖1 無(wú)菌發(fā)酵與傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵過(guò)程中茶多糖的含量變化Fig.1 The variation of tea polysaccharides in sterile and traditional fermentation

2.2 普洱茶渥堆發(fā)酵樣中分離純化出的真菌

以不同發(fā)酵階段的普洱茶渥堆樣(共21個(gè))為材料,對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵中真菌進(jìn)行分離純化,并統(tǒng)計(jì)不同菌株出現(xiàn)的頻率。如表1所示,共計(jì)22種。其中PEZJ-1,PEZJ-5,PEZJ-8,PEZJ-9,PEZJ-10為普洱茶渥堆發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌,在不同階段的普洱茶發(fā)酵樣中經(jīng)常反復(fù)出現(xiàn),并可將單菌種接種至茶葉中進(jìn)行茶葉微生物發(fā)酵。其他菌株僅在普洱茶渥堆發(fā)酵的某一階段檢出或在某個(gè)渥堆發(fā)酵樣中偶爾檢出,且單菌種接種至茶葉中不存活或不引起茶葉的顯著變化。因此,以PEZJ-1,PEZJ-5,PEZJ-8,PEZJ-9,PEZJ-10為普洱茶渥堆發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌篩選出可增加茶多糖含量的優(yōu)勢(shì)菌。

表1 不同微生物形態(tài)特征描述Table 1 The description of different microorganism characteristics

2.3 優(yōu)勢(shì)菌單菌種發(fā)酵對(duì)茶多糖含量的影響

在實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌條件下接種單菌種,茶多糖的變化趨勢(shì)如圖2所示。在單菌種茶葉發(fā)酵前期,茶多糖含量均顯著性增加。這與微生物對(duì)纖維素的分解代謝有關(guān)。在發(fā)酵后期,由于微生物對(duì)茶多糖代謝的差異,茶多糖的保留量明顯不同。在PEZJ-5,PEZJ-9的單菌種茶葉發(fā)酵中,茶多糖整體無(wú)顯著性變化。在PEZJ-1的單菌種茶葉發(fā)酵中,茶多糖含量持續(xù)上升,在發(fā)酵第35 d達(dá)到最大,為23.57%±0.7%,是原料的2.58倍。PEZJ-1可能為增加茶多糖含量的優(yōu)勢(shì)菌。茶多糖的大幅度增加與該菌對(duì)茶多糖的利用有限有關(guān)。

圖2 茶葉單菌種發(fā)酵過(guò)程中茶多糖含量的變化Fig.2 The variation of tea polysaccharides in tea fermentation by single strain

2.4 自然狀態(tài)優(yōu)勢(shì)菌接種發(fā)酵對(duì)茶多糖含量的影響

為了探究在自然狀態(tài)下,微生物對(duì)茶多糖含量的影響,篩選出可應(yīng)用于生產(chǎn)中的產(chǎn)茶多糖菌株,5株菌株的菌粉按照一定比例分別添加到云南大葉種曬青毛茶進(jìn)行自然潮水渥堆發(fā)酵,并測(cè)定不同階段茶多糖含量。不同菌株茶葉發(fā)酵中茶多糖含量如圖3所示。在自然條件下,五株菌株的接種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,茶多糖的變化規(guī)律與實(shí)驗(yàn)室條件下單菌種茶葉發(fā)酵基本一致。整體上,PEZJ-5,PEZJ-9對(duì)茶多糖含量影響不大;在發(fā)酵末期,茶多糖含量較原料有所下降,降幅分別為17.7%和4.8%。PEZJ-1,PEZJ-8和PEZJ-10均能顯著提高茶多糖含量。在PEZJ-8和PEZJ-10的自然接種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,茶多糖呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì);在發(fā)酵結(jié)束時(shí),茶多糖含量較原料分別增加73.8%和48.9%。在PEZJ-1發(fā)酵過(guò)程中茶多糖含量持續(xù)上升。在發(fā)酵第35d后,茶多糖含量達(dá)到最大,為27.85%±0.5%,為原料的2.21倍。因此斷定PEZJ-1為普洱茶發(fā)酵中產(chǎn)茶多糖的優(yōu)勢(shì)菌株。

圖3 自然狀態(tài)下茶葉接種發(fā)酵過(guò)程中茶多糖含量變化Fig.3 The variation of tea polysaccharides during tea inoculated fermentation under natural conditions

2.5 優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定結(jié)果

PEZJ-1在PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征如圖4所示。PEZJ-1在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑3.4 cm,黑色粉狀,扁平,邊緣白色整齊,氣生菌絲稀少;菌落背面乳白夾黑色。PEZJ-1在察氏培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)3.2cm,白色至棕黑色,扁平,絨粉狀邊緣整齊,有放射狀溝紋,中間有粉紅色顆粒狀菌核;菌落背面淺棕褐色,有曲線狀放射溝紋。PEZJ-1的分生孢子形態(tài)特征如圖5所示。PEZJ-1菌株的菌絲發(fā)達(dá)多分枝、有隔膜多核;分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細(xì)胞(足細(xì)胞)上垂直生出,頂部形成球形頂囊,其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗,小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀分生孢子,粗糙,直徑3.0～4.75 μm;分生孢子頭球狀如“菊花”,呈褐黑色直徑700～800 μm。

圖4 PEZJ-1菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of PEZJ-1 strain on culture medium 注:a為PDA培養(yǎng)基正面,b為PDA培養(yǎng)基背面,c為察氏培養(yǎng)基正面,d為察氏培養(yǎng)基背面。

圖5 PEZJ-1在電子顯微鏡下的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of PEZJ-1 under transmission electron microscope

對(duì)PCR產(chǎn)物通過(guò)DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果并將所獲序列提交到NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索,并調(diào)出相關(guān)菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列(圖6)。通過(guò)在線Blast比對(duì)檢索,目標(biāo)菌株屬于曲霉屬,與菌株AspergillusnigerNCBT110A相似性為99.8%。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖7),結(jié)合其菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)觀察,將目標(biāo)菌株鑒定為:黑曲霉(Aspergillusniger)。

圖7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree

圖6 ITS1-5.8S-ITS2 rRNA序列Fig.6 The sequences of ITS1-5.8S-ITS2 rRNA

3 結(jié)論與討論

在普洱茶傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵過(guò)程中,由于微生物的參與,茶多糖含量有一定程度的增加。本文以理想條件下的滅菌處理作為對(duì)比,推斷出茶多糖的增加與普洱茶渥堆中微生物的參與,特別是種類繁多、代謝旺盛的真菌密切有關(guān)。

本研究以不同階段的普洱茶渥堆發(fā)酵樣為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)PDA培養(yǎng)基對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵中出現(xiàn)的真菌進(jìn)行分離純化,共分離純化出22株真菌。大多數(shù)菌株僅在發(fā)酵的某一階段或某一個(gè)發(fā)酵樣中偶爾檢出。而PEZJ-1、PEZJ-5、PEZJ-8、PEZJ-9、PEZJ-10等5株真菌在不同階段普洱茶渥堆發(fā)酵樣中頻繁檢出,且能單菌種接種至茶葉使茶葉形態(tài)發(fā)生深刻變化。因此,以此5株真菌為實(shí)驗(yàn)菌株,通過(guò)單菌種發(fā)酵和接種發(fā)酵,篩選可增加茶多糖含量的優(yōu)勢(shì)菌株。并根據(jù)菌落特征、分生孢子結(jié)構(gòu)、DNA序列,對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定。

在5種菌株中,PEZJ-5,PEZJ-9整體上對(duì)茶多糖無(wú)顯著影響,PEZJ-1、PEZJ-8、EZJ-10等3種菌株在理想條件下的單菌種發(fā)酵和自然狀態(tài)下的接種發(fā)酵中均能顯著提高茶多糖。特別是PEZJ-1能大幅度提高茶多糖含量,在單菌種發(fā)酵與接種發(fā)酵中,茶多糖含量分別為23.57%和27.85%,與原料相比,茶多糖增幅分別為158%和121%,為普洱茶渥堆發(fā)酵中可增加茶多糖含量的優(yōu)勢(shì)菌株。通過(guò)菌落形態(tài)觀察、分生孢子顯微特征分析以及18S rDNA測(cè)序鑒定PEZJ-1菌株為黑曲霉(Aspergillusniger),為茶多糖保健品的開(kāi)發(fā)提供一定參考。

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Screening and identification of a strain capable of producing tea polysaccharide from pu-erh tea fermentation

WANG Hong-zhen1,MA Cun-qiang1,2,REN Xiao-ying2,WANG Pan1,ZHOU Bin-xing1,3,*

(1.LongRun Pu-erh Tea College,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 2.Kunming Dapu Tea Industry Co.,Kunming 650224,China; 3.College of Tea and Food Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

With samples from different stages of pu-erh tea fermentation as experimental material,fungi were isolated and purified. The isolated strains were conducted tea single strain fermentation under ideal condition and inoculated fermentation to screen out a dominant strain capable of increasing tea polysaccharides.The results showed that 22 strains were isolated and purified from pu-erh tea solid-state fermentation,5 dominant strain used in inoculated fermentation were high frequency in pu-erh tea.During the fermentation by isolated strains,tea polysaccharides increased significantly(p<0.05). Especially in fermentation inoculated by PEZJ-1,tea polysaccharides increased most obviously and reached 23.57% and 27.85% under ideal condition and inoculated fermentation,respectively. Based on the colonial morphology,conidium microscopic characteristics and 18S rDNA gene sequence,the strain of PEZJ-1 was identified asAspergillusniger. Therefore,in pu-erh tea solid-state fermentation,exogenous inoculation could improve tea polysaccharides significantly. AndAspergillusnigerenhanced tea polysaccharides by a wide margin,which provides the microbial strain for the development of tea polysaccharides.

tea polysaccharides;pu-erh tea;screening;identification;Aspergillusniger

2016-09-06

王洪振(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：茶葉加工與綜合利用，E-mail：1711842897@qq.com。

*通訊作者:周斌星(1963-)，男，博士，副教授，研究方向：茶葉加工，E-mail：bxzhou01@126.com。

紫鵑茶樹(shù)調(diào)控花色苷生物合成的MBW轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究(C161104);保山市名優(yōu)綠茶加工工藝研制開(kāi)發(fā)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.022