魏衍尚， 寧利敏， 姚 忠， 朱本偉

（南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 210009）

卡拉膠是一種從海洋紅藻細胞壁中提取出來的多糖物質，是一種由D-半乳糖通過交替的α-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的線性硫酸多糖[1]。因其具有多樣的生物活性而受到廣大關注?？ɡz多糖根據硫酸基團的數(shù)量和位置以及α-1，4連接的半乳糖殘基中3，6-內醚-α-D-吡喃半乳糖（3，6-AG）的存在，可將其分為κ-、ι-和λ-型3種卡拉膠，其對應的重復二糖結構分別為：G4S-DA、G4S-DA2S和G2S-D2S，6S（見圖1）[2]?？ɡz因其出色的物理功能特性而得到廣泛的利用，如增稠、膠凝和穩(wěn)定能力[1]。然而，由于這種硫酸多糖的高相對分子質量和較差的組織穿透能力，大大限制了它們的進一步應用。

圖1 不同類型卡拉膠的重復二糖結構Fig.1 Schematic diagram of repeated disaccharide structure of different types of carrageenan

研究表明，經過降解后產生的卡拉膠寡糖或者降解后的卡拉膠經過分子修飾的衍生物往往有著更強的生物活性[3]?？ɡz的酶降解需要涉及卡拉膠酶和硫酸化酶兩種酶的共同作用，前者降解糖苷鍵，后者脫去卡拉膠分子上的硫酸基團[4-6]。因此作者總結了卡拉膠的多種降解方法以及降解后的卡拉膠所進行的分子修飾，并對其降解后的生物活性做了簡單的概述。同時重點概括了近20年來卡拉膠酶和硫酸化酶的研究進展，還在最后介紹了兩種酶協(xié)同降解卡拉膠多糖的機制。

1 卡拉膠多糖的降解及分子修飾

天然提取的卡拉膠因相對分子質量太大、黏度高、溶解度低等特點，難以通過機體內的屏蔽作用，致使其應用受到很大程度的限制[7]。相比之下，卡拉膠寡糖及其分子修飾后的衍生物具有更為廣泛的應用價值[8]。針對這一問題，目前對于卡拉膠多糖的研究主要集中在多糖降解或降解后的卡拉膠的分子修飾。

1.1 卡拉膠多糖的降解方法

1.1.1 化學降解在化學降解方面可通過用無機酸水解、硫醇水解、甲醇水解、還原水解、過氧化氫氧化水解等方法來將大分子卡拉膠降解為小分子多糖，甚至寡糖[3]。其中研究最多的為無機酸的水解，在酸性溶液中，卡拉膠多糖的糖苷鍵會發(fā)生斷裂，從而使多糖降解為小分子片段[3]。通過控制酸的濃度、溫度以及時間可獲得相對分子質量大小不一的降解產物。

通過酸水解可以獲得多種卡拉膠低聚糖及寡糖組分[9-10]。Yang等通過溫和酸水解方法（用0.1 mol/L H2SO4在60℃降解1.5 h）得到聚合度3～17奇數(shù)κ-卡拉膠寡糖[11]。Hipolito等對κ-卡拉膠采用0.1 mol/L TFA在65℃降解30 min來進行部分水解，其水解產物為低相對分子質量多糖片段[12]。

對比其他降解方法，酸降解不易控制反應條件，降解產物復雜，并且會對多糖結構造成破壞，進而影響生物活性[13]。

1.1.2 物理降解物理降解主要有超聲降解、輻射降解、微波降解。用γ射線在固體、凝膠或溶液中以不同劑量照射，可降解κ-、ι-和λ-卡拉膠，且得到的產物相對分子質量分布窄[14]。魏元臣等通過微波降解法得到的不同相對分子質量λ-卡拉膠，并且證明了降解產物能夠使健康小鼠的免疫能力增強[15]。對于超聲波降解多糖，其反應過程中易于控制反應條件，便于得到目標產物，且解聚物為具有較窄相對分子質量分布的產物。Tecson等采用低質量濃度的κ-卡拉膠底物（5.0 mg/mL）、高振幅的儀器處理（85%）和長處理時間（180 min）的超聲波處理，獲得了平均相對分子質量（AMW）為41 864的κ-卡拉膠，這比初始AMW為1 139 927的原始樣品減少了1 098 063（96.3%）[16]。

1.1.3 酶降解由于化學降解和物理降解的降解條件不易控制，且極易引起多糖結構的破壞，因此生物降解法受到了研究者們極大的關注[17]。卡拉膠酶是一種糖苷水解酶，可以降解卡拉膠的β-1，4糖苷鍵，從而獲得卡拉膠低聚糖。由于酶法降解具有底物專一性、高效性、對環(huán)境友好、無副反應、工藝易于控制等優(yōu)點，是一種理想的降解方式，目前已逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的降解方法。

1.2 降解后的卡拉膠多糖的分子修飾

研究者提出了許多化學修飾方法來修飾卡拉膠的理化性質。大多數(shù)修飾的目的是通過用新的官能團取代生物聚合物D-半乳糖-4-硫酸鹽部分中的原醇基團來誘導新的性質。改性反應包括硫酸化[18]和脫硫酸化[19]、乙?；痆20]、烷基化[12]、磷酸化[21]、自由基接枝共聚等[22]。

卡拉膠的硫酸化方法有很多，通過硫酸鹽基團的引入，可以在一定程度上改變卡拉膠多糖的生物活性，其中最常用的3種包括氯磺酸-吡啶法[23]、硫酸化法[24]和三氧化硫-吡啶法[25]。對于脫硫酸化，則涉及卡拉膠硫酸化酶，詳情見下文。乙?；瘎t通過?；D移酶催化，這種化學修飾不僅可以影響不同化合物的功能，而且可以改變溶解度、穩(wěn)定性或細胞靶的不同性質[26-27]。Yamada等發(fā)現(xiàn)，乙?；牡拖鄬Ψ肿淤|量硫酸卡拉膠具有潛在的抗HIV活性；同時，卡拉膠多糖在水中的溶解度直接受到乙?；潭鹊挠绊?；λ-和κ-卡拉膠的高取代率表明其不溶于水[28]。卡拉膠的烷基化也會對卡拉膠的生物活性產生影響。Uryu等對硫酸寡糖進行分子修飾，引入烷基，發(fā)現(xiàn)其修飾產物抗HIV的能力得到了提高，而不含烷基的硫酸寡糖抗HIV活性較低[29]。袁華茂通過對降解得到的卡拉膠寡糖混合物進行了磷酸化結構修飾，結果表明硫酸化后的卡拉膠在不同的抗氧化模型中具有較卡拉膠寡糖更高的抗氧化活性，說明卡拉膠寡糖的化學修飾可以增強其抗氧化能力[30]。

除了上述的功能化方法外，接枝和交聯(lián)還可用于化學改性聚合物。將可聚合的合成部分接枝到天然卡拉膠多糖上，然后進行聚合，這是一種產生大分子的方法，合成的大分子具有每種聚合物的某些特性[31]。例如，在κ-卡拉膠上接枝丙烯酸，合成了κ-卡拉膠型高吸水凝膠[32]。

2 卡拉膠酶的研究

卡拉膠酶歸屬于糖苷水解酶家族，其作用模式均為內切型，可專一性的裂解卡拉膠分子內部的β-1，4糖苷鍵，產物為一系列聚合度為偶數(shù)的低聚卡拉膠[33]。由于卡拉膠酶在水解卡拉膠多糖的過程中，反應條件溫和，底物具有專一性以及所產生的產物均一，因此該法正受到越來越多的關注[8]。近年來，針對海洋微生物所產生的卡拉膠酶對卡拉膠多糖的降解和利用的研究，主要集中在卡拉膠酶的性質、結構與功能之間的關系等。作者將從卡拉膠酶的來源、種類、酶學性質、結構和催化機制以及應用這幾個方面來介紹卡拉膠酶的研究進展。

2.1 卡拉膠酶的來源與種類

卡拉膠酶的來源主要是海洋微生物和海洋動物。比如以海藻為食的軟體動物，Mori等從海洋軟體動物中純化并鑒定了第一種卡拉膠酶[34]。Skea等在新西蘭食草魚內臟中曾提取到可降解卡拉膠的酶[35]。然而，對于大多數(shù)已報道的卡拉膠酶，均是從海洋微生物中分離出來的。產卡拉膠酶的海洋微生物種類主要包括Pseudomonas、Pseudoalteromonas、Vibrio、Shewanella、Cellulophaga、Cytophaga、Microbulbifer、Tamlana、Pedobacter、Alteromonas和Zobellia等。在已發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶中，根據其降解底物的專一性，主要分為κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶、λ-卡拉膠酶。

2.1.1 κ-卡拉膠酶κ-卡拉膠酶是所有卡拉膠酶中分布與應用最為廣泛的一種酶，屬于16糖苷水解酶家族。該類型的酶能夠特異性水解β-4-硫酸-D-半乳糖和α-3，6內醚-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新κ-卡拉寡糖為主的產物[33]。具有一定活性的κ-卡拉膠酶可從海洋細菌或動物體內某些組織獲得。根據目前已有報道，能夠產生κ-卡拉膠酶的菌株包括Alteromonas macleodii KS62[36]、Bacillus sp.SYR4[37]、Cytophaga MCA-2[38]、Cellulophaga lytica[39]、Pedobacter hainanensis 13-Q[40]、Pseudoalteromonas sp.ZDY3[41]、Pseudomonas aeruginosa ZSL-2[42]、Pseudomonas elongata MTCC 5261[43]、Pseudomonas carrageenovora HLX250[44]、Pseudoalteromonas porphyrae LL-1[45]、Pseudoaltero-monas carrageenovora NCMB.302[46]、Shewanella sp.Kz7[47]、Vibrio sp.SY01[48]、Pseudoalteromonas tetraodonis JAMK142[49]、Tamlana sp.HC4[50]等。Kalitnik等 從 紅 藻Tichocarpus crinitus中篩選出28株具有降解κ-卡拉膠能力的菌株，且他們均屬于Phyla-bacteroidetes和Proteobacteria種類[51]。也有研究表明，海洋環(huán)境中存在大量的細菌細胞外膜囊泡攜帶具有活性的κ-卡拉膠酶[36]。海洋無脊椎動物Turbo cornutus的腸道中也被證明了可以分離出一種能降解瓊脂、藻酸鹽和κ-卡拉膠的Microbulbifer agarilyticus GP101[52]。

研究表明，κ-卡拉膠酶是對其κ-卡拉膠內部的β-1，4鍵上進行剪切[40]。在降解過程中，κ-卡拉膠酶對卡拉膠的降解是隨機的，且當卡拉膠為凝膠狀時卡拉膠酶對其的降解速率最快[46]。通過κ-卡拉膠酶降解卡拉膠得到的低聚糖具有更高的同質性和更低的多分散性[53]。對于高聚合度的κ-卡拉膠寡糖的制備，Cui等從Cellulophaga lytica strain N5-2中克隆并異源表達了一個新的κ-卡拉膠酶基因，其降解產物為新κ-卡拉辛糖和新κ-卡拉己糖[39]。

對于κ-卡拉膠的降解，酶法水解相較于化學水解有許多優(yōu)點，但其明顯的缺點是酶的活性低，需要較長的反應時間，其他缺點包括酶活性的自發(fā)喪失和酶具有更昂貴的價格，這意味著還需要進一步探索酶的再利用[54]。而對于自由酶來說，需面臨較多工業(yè)挑戰(zhàn)，包括在非自然環(huán)境中穩(wěn)定性低、分離和回收困難[55]。為了克服這些問題，酶固定化技術已被廣泛用于提高酶的穩(wěn)定性和可重復使用性。通過分子動力學模擬以及圓二色光譜分析將κ-卡拉膠酶CgkPZ和Ca2+進行組裝，合成一種新型的自組裝κ-卡拉膠酶-無機雜化納米花CaNF@CgkPZ，且催化效率增加了292%[56]。

在現(xiàn)有的實驗中，通過重組菌株培育出的κ-卡拉膠酶對卡拉膠的降解可以獲得很多具有活性的低聚卡拉膠。例如，Pseudoalteromonas porphyrae LL1的κ-卡拉膠酶的催化結構基因在Brevibacillus choshinensis中有效表達，且100.0 mmol/L的Mg2+能使PpCgkCD的活性顯著提高97.5%[57]。張成昊等將Pseudoalteromonas JMUZ2的κ-卡拉膠酶基因在大腸桿菌中異源表達，結果表明，該酶屬于GH16家族，最適反應溫度和pH分別為50℃和8.0，重組酶對去垢劑Tween 20、Tween 80和Triton X-100有良好的耐受性，酶解產物對羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基具有一定清除作用，還具有良好的還原能力[58]。對從南極大型海藻表面分離的Polaribacter sp.NJDZ03的全基因組進行了分析，獲得了一個推測的卡拉膠酶基因Car3206，且該基因被克隆并在大腸桿菌中獲得高效表達[59]。

由于卡拉膠具有較高的結構異質性，存在著典型的雜交卡拉膠。其中一種其結構由交替β-卡拉膠和κ-卡拉膠基序組成。Cao等克隆、表達和表征了來自海洋細菌Wenyingzhuangia funcanilytica CZ1127的新型GH16_13 furcellaran（一種部分硫酸化的β/κ-卡拉膠）水解酶Cgbk16A_Wf，該酶被命名為βκ-卡拉膠酶，可以特異性地將β-卡拉膠和κ-卡拉膠之間的β-1，4糖苷鍵從非還原端切割到還原端，其相對分子質量為43 000，且作用模式不依賴于NaCl，被Cu2+、Mg2+、Hg2+、Mn2+、β-巰基乙醇抑制，在50℃和pH 6.0下表現(xiàn)出最大活性，并表現(xiàn)出高熱穩(wěn)定性[60]。

2.1.2 ι-卡拉膠酶有關ι-卡拉膠酶的報道較少，該酶屬于82糖苷水解酶家族。該類型的酶能夠特異性水解β-4-硫酸-D-半乳糖和α-2-硫酸-3，6-內醚-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新ι-卡拉寡糖為主的產物[33]。根據目前已有報道，能夠產生ι-卡拉膠酶的菌株包括Alteromonas fortis[61]、Brevibacillus choshinensis[62]、Cellulophaga sp.QY3[63]、Flavobacterium sp.YS-80-122[64]、Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T[65]等。

Barbeyron等對來自Zobellia galactanovorans和Alteromonas fortis的兩種ι-卡拉膠酶進行分析比對，結果表明，Z.galactanovorans和A.fortis ι-卡拉膠酶基因編碼的同源蛋白質相對分子質量分別為53 400和54 800，相似性達到59%，同源性達到43%，且這兩種酶都能專一性降解ι-卡拉膠，作用方式均為內切[66]。

ι-卡拉膠酶從Alteromonas fortis中首次被提取并表征其酶學性質[61]。Hatada等從Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T的基因組中獲得一個ι-卡拉膠酶基因，酶解終產物ι-卡拉四糖占總產物的75%以上，這種酶可能有助于工業(yè)生產單一的ι-卡拉膠低聚糖，此外還證明了保守的Glu351對催化作用至關重要[65]。Ma等從Cellulophaga sp.和Cellulophaga sp.QY3中分離并鑒定了兩種新的ι-卡拉膠酶，不僅豐富了GH82家族ι-卡拉膠酶資源，而且對GH82家族酶的結構與功能闡釋有重要意義[63，67]。

有研究報道，ι-卡拉膠酶Cgi82A在大腸桿菌中表達，并對其生化特性、動力學常數(shù)和水解模式進行了表征，該酶在25℃時達到最高活性，低于迄今報道的所有GH82 ι-卡拉膠酶，它是一種內源性水解酶，可作為一種潛在的生物催化劑，制備不同聚合度的卡拉膠寡糖[68]。最近，來自Cellulophaga baltica的ι-卡拉膠酶的酶學性質也被進行報道，并且通過單因素實驗優(yōu)化了最大ι-卡拉膠酶產量[69]。

2.1.3 λ-卡拉膠酶對于λ-卡拉膠酶的報道很少，由于缺少其序列信息，因此該酶構成了與包含κ-卡拉膠酶的GH16家族和包含ι-卡拉膠酶的GH82家族沒有關系的一個新的GHs家族[70]。該類型的酶能夠特異性水解β-2-硫酸-D-半乳糖和α-2，6-硫酸-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新λ-卡拉寡糖為主的產物[33]。根據目前已有報道，能夠產生λ-卡拉膠酶的菌株包括Bacillus sp.Lc50-1[71]、Pseudoalteromonas sp.CL19[72]、Pseudoalteromonas carrageenovora[73]等。

1955年，Gauthier等發(fā)現(xiàn)了一種來自海藻細菌Pseudoalteromonas carrageenovora的λ-卡拉膠酶，并對其基因進行了克隆[73]。2006年，Ohta等從深海沉積物樣品中分離到一株含有λ-卡拉膠酶的Pseudoalteromonas sp.CL19菌株并對其進行了純化及表征，這是首次分離λ-卡拉膠酶及其基因序列的報道[72]。2014年，首次證實溫泉細菌中存在耐熱性λ-卡拉膠酶，并且純化并表征其生理活性[71]。2015年，有相關報道指出通過λ-卡拉膠酶降解所獲得的λ-卡拉膠寡糖具有抗腫瘤和血管生成的活性，并且這種活性與該卡拉膠的聚合程度有關[74]。

2.2 不同種類卡拉膠酶的酶學性質

2.2.1 κ-卡拉膠酶的酶學性質已報道的κ-卡拉膠酶的相對分子質量分別在20 000～128 000。最小和最大的相對分子質量分別是來自Zobellia sp.ZM-2和Pseudomonas elongata MTCC 5261的κ-卡拉膠酶，其對應相對分子質量為20 000和128 000[43，75]。根據已有報道，大部分κ-卡拉膠酶的最佳溫度在30～55℃。但也有一些酶的最適溫度超出此范圍，例如，來自Cytophaga sp.Ik-C783、Pseudoalteromonas sp.WZUC10和Wenyingzhuangia aestuarii OF219的κ-卡拉膠酶，其最佳溫度為25℃[76-78]。 而來自Bacillus sp.HT19的κ-卡拉膠酶的最佳溫度為60℃，是迄今為止最具耐熱性能的κ-卡拉膠酶，具有一定程度的應用潛力[79]。大多數(shù)報道的κ-卡拉膠酶的最佳pH范圍是7.2～8.0，這與海水的pH接近。然而，一些卡拉膠酶在酸性（pH 6）或中性（pH 7）條件下顯示其最佳活性。例如，來自Zobellia sp.ZM-2和Cellulophaga lytica strain N5-2的κ-卡拉膠酶的最適pH分別為6和7[75，80]。此外，一個特殊的例子是，從Pseudomonas elongata MTCC 5261中分離出的κ-卡拉膠酶其活性在酸性（pH 5.6）和堿性（pH 7.7）中都是最佳的[43]。其他κ-卡拉膠酶的酶學性質見表1[36-50，53-54，59，75-88]。

表1 κ-卡拉膠酶的酶學性質Table 1 Enzymatic properties of κ-carrageenase

續(xù)表1

2.2.2 ι-卡拉膠酶的酶學性質有關ι-卡拉膠酶的酶學性質報道較少（見表2），其相對分子質量在31 000～58 000。最小的和最大的相對分子質量分別是來自Cellulophaga baltica和Brevibacillus choshinensis的ι-卡拉膠酶，其對應相對分子質量 為31 000和58 000[62，69]。來 自Cellulophaga sp.QY3、Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T的ι-卡拉膠酶最適溫度為50℃，是迄今為止所報道的ι-卡 拉 膠 酶 的 最 佳 溫 度[63，65]。 而 來 自Wenyingzhuangia fucanilytica的ι-卡拉膠酶在25℃時可達到最高活性，低于目前報道的所有GH82 ι-卡拉膠酶[68]。對于來自Flavobacterium sp.YS-80-122的ι-卡拉膠酶在溫度為10℃和15℃下分別顯示出最大活性的36.5%和57%，而且在熱休克后恢復了58.2%的初始活性，這表明該酶是具有抗寒性、耐熱性，同時該酶還表現(xiàn)出NaCl獨立性和高的新ι-卡拉四糖產率，這將是海藻多糖生產ι-卡拉膠寡糖工業(yè)應用的優(yōu)質候選者[64]。目前已報道的ι-卡拉膠酶的最適pH在6.5～8.0。值得注意的是，來自Brevibacillus choshinensis與Cellulophaga sp.的ι-卡拉膠酶分別在pH 6.0～11.0與pH 6.0～9.6相對較寬范圍內表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性[62，67]。

表2 ι-卡拉膠酶的酶學性質Table 2 Enzymatic properties of ι-carrageenase

2.2.3 λ-卡拉膠酶的酶學性質目前僅有3種λ-卡拉膠酶的酶學性質被報道（見表3）。1995年，Gauthier等報道了來自Pseudoalteromonas carrageenovora的λ-卡拉膠酶，其相對分子質量為105 000，是迄今為止相對分子質量最大的λ-卡拉膠酶[73]。2006年，Ohta等報 道了來 自Pseudoalteromonas sp.CL19的λ-卡拉膠酶，該酶的相對分子質量約為100 000，最佳pH和活性溫度分別約為7和35℃，最終產物主要為λ-卡拉膠理想結構的四糖[72]。2014年，Li等報道了來自Bacillus sp.Lc50-1的λ-卡拉膠酶，該酶可以在75℃下降解λ-卡拉膠，屬于一種耐熱的λ-卡拉膠酶，并且該酶在pH 6～9下穩(wěn)定，且在85℃下保持約50%的活性，并持續(xù)10 min[71]。

表3 λ-卡拉膠酶的酶學性質Table 3 Enzymatic properties of λ-carrageenase

2.3 不同種類的卡拉膠酶序列分析

序列比較是生物信息學中最基本、最重要的操作。比較序列之間的相似性和差異性對于分析序列的結構特征、親緣關系、進化地位及生物功能等方面具有重要的意義和價值[89]。

針對κ-卡拉膠酶，Barbeyron等分別從Alteromonas carrageenovora與Cytophaga drobachiensis中克隆出兩種新的κ-卡拉膠酶基因，并表明κ-卡拉膠酶中的Glu163殘基對酶的催化作用很重要，且得出GH16糖苷水解酶家族之間的一般同源性是通過基因復制產生的結論[90-91]。近年來，相繼從Pseudoalteromonas tetraodonis、Zobellia sp.ZM-2、Pseudoalteromonas sp.QY203中克隆并表征出幾種新的κ-卡拉膠酶基因[49，75，84]。值得注意的是，來自Pseudoalteromonas tetraodonis與Pseudoal-teromonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶具有高度相似性，同源性為94%[49]。對于以上幾種κ-卡拉膠酶，做出序列比對，結果如圖2所示 （其中GenBank為ADD92366.1、AHN05534.1的兩種κ-卡拉膠酶的蛋白質序列已上傳，但并未有相關文獻進行描述）。結果 發(fā) 現(xiàn)，來 自Pseudoalteromonas sp.QY203與Pseudoalteromonas carrageenovora的同源性最高，達到了97%。對于參與底物結合和活性催化所必需的幾個殘基在這些序列中高度保守，如Glu171、Asp173、Glu176、Asp194、Leu197、Ser271和Leu274，其中3個殘基（Glu171、Asp173和Glu176）參與底物的結合[92]。

圖2 不同來源的κ-卡拉膠酶的多序列比對Fig.2 Multi-sequence alignment of κ-carrageenases from different sources

對于ι-卡拉膠酶，目前有7種基因已被克隆分析。早期，Barbeyron等從Zobellia galactanovorans中克隆出一種新的ι-卡拉膠酶基因，并表明該卡拉膠酶是一個與κ-卡拉膠酶家族不相關的新家族[66]。之后，隨著對ι-卡拉膠酶的深入探索，又從Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T與Wenyingzhuangia fucanilytica、Brevibacillus choshinensis中鑒定出3種新的ι-卡拉膠酶基因[62，65，68]。值得注意的是，Ma等從Cellulophaga sp.和Cellulophaga sp.QY3克隆出兩種新的ι-卡拉膠酶基因，并表明存在3個嚴格保守的殘基（G228、Y229、R254）對底物結合起重要作用[63，67]。近年來，Li等從Flavobacterium sp.YS-80-122中克隆并表征了一種具有耐寒性、耐熱性的新的ι-卡拉膠酶基因[64]。從ι-卡拉膠酶序列比對圖得出，來自Cellulophaga sp.QY3與來自Zobellia galactanivorans的同源性最高，達到了79%（見圖3）。

圖3 不同來源的ι-卡拉膠酶的多序列比對Fig.3 Multi-sequence alignment of ι-carrageenases

關于λ-卡拉膠酶，目前已發(fā)現(xiàn)兩種該酶的基因，且同源性達到98%，故不在此做序列分析。

2.4 卡拉膠酶結構和作用機制

2.4.1 卡拉膠酶的結構目前，針對卡拉膠酶的研究較少，僅有4個卡拉膠酶的晶體結構被完整表征出來。第一個得到結構解析的卡拉膠酶是來自于Pseudomonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶（PcCgkA）[92]。 此 外， 還 有 來 自Zobellia galactanivorans DsiJT的ZgCgkA[93-95]、Alteromonas fortis的ι-卡拉膠酶（CgiA）[96]和來源于Bacteroides ovatus的外切卡拉膠酶[95-97]。

PcCgkA和ZgCgkA都屬于κ-卡拉膠酶，它們兩者的結構非常相似，都屬于β-夾心結構，其中包括兩個反向平行的β-折疊片和6個延伸帶構成的活性裂縫[95]。在二級結構層面，該β型果凍卷折疊是由3個小的反平行的β-折疊片和一條α螺旋組成。β-折疊片兩兩反向堆積形成催化腔，如隧道狀鑲嵌在三明治狀的結構中，隧道狀催化中心的裂縫位置便是酶與底物的結合處，這種隧道活動場所暗示著一種過程性的作用模式（見圖4（a）和（b））。

圖4 不同家族的卡拉膠酶結構Fig.4 Structure of different families of carrageenan

PcCgkA和ZgCgkA之間也存在微小的差異。第一個明顯區(qū)別是κ-卡拉膠酶的模塊結構。即使兩者都是分泌酶，但只有ZgCgkA擁有一個CBM（碳水化合物結合模塊）。附加在催化GH模塊上的CBM的存在，一般與相鄰的酶在固體形式下處理頑固的、復雜的底物有關，如在植物細胞壁中所遇到的情況[98-100]。這也從一定方面說明從菌體中分泌的ZgCgkA可能會降解海藻細胞壁內的半結晶κ-卡拉膠。此外，與PcCgkA相反，DP6不被ZgCgkA水解，也就是說DP8是能被ZgCgkA降解的最小寡糖[101]。對于PcCgkA，DP6完全由隨機加工產生，而DP4由隨機和過程性作用模式產生[46]。對于同類型酶的結構多樣性可能是由各種進化事件造成的，如水平基因轉移或序列復制后的分化進化等。

CgiA晶體結構的分析是82家族糖苷水解酶的首次報道。CgiA的結構為右手平行的β-螺旋狀結構，由10個完整的具有右旋性的平行β-螺旋結構和表面Loop組成 （見圖4（c））。與PcCgkA和ZgCgkA相比，CgiA具有兩個額外的C端結構域（A結構域和B結構域）。結構域A類似于DNA/RNA的結合蛋白質，結構域B則是由兩個二硫鍵組成的環(huán)構成。Glu245、Asp247或Glu310在酶的裂縫中被認為是候選的催化殘基。同時，該酶還含有一個鈉和一個氯化物結合位點以及3個鈣結合位點，這表明這些離子會參與穩(wěn)定酶結構。

來自Bacteroides ovatus的卡拉膠酶（BovGH167）結構顯示了4個結構域，其中3個在GH42家族中經常見到（見圖4（d））。保守域是結構域A，催化（α/β）8-桶狀結構域；結構域B是一個由α-螺旋包圍的5股平行β片；結構域C是一個反平行的β-三明治狀，獨特的結構域是在N端有一個全α螺旋的區(qū)域。

2.4.2 卡拉膠酶的催化機制根據糖水解酶在水解過程中其異頭碳的構象是否變化，可分為兩類：保持型和倒置型。

1995年，Potin等從Alteromonas carrageenovora細菌中純化出一種κ-卡拉膠酶，并且對其進化和水解機制進行了表述[102]。該酶的N末端的信號肽和C末端均被加工。通過免疫印跡法表明，成熟的κ-卡拉膠酶須由一個前體蛋白質在分泌過程中經過兩次水解才能獲得。在該酶水解κ-卡拉膠后，利用凝膠過濾色譜和13C-NMR分析水解產物新κ-卡拉六糖，發(fā)現(xiàn)該寡糖異頭碳的構象并沒有發(fā)生改變，這表明在酶解過程中異頭碳的構象未發(fā)生變化是屬于保持異構構型的分子機制（見圖5）。這一結果同GH16糖苷水解酶家族的其他糖苷水解酶在酶解過程中的催化機制相一致。

κ-卡拉膠酶的反應機制如下，酶結構催化腔主要參與催化作用的氨基酸分別是Glu163、Glu168、Asp165，其中谷氨酸殘基E163作為親核催化，谷氨酸殘基E168作為酸堿催化，而天冬氨酸D165可以促進中間轉換狀態(tài)的解體。在催化開始時，底物-1處的精氨酸殘基R260將會結合κ-卡拉膠的硫酸脂基，其目的是用于識別底物，保證酶的專一性。該酶的反應機理為雙置換反應，具體反應過程如圖5所示。

圖5 κ-卡拉膠酶通過雙置換反應降解卡拉膠的保留機制Fig.5 Retention mechanism of κ-carrageenase degradation of carrageenan by double substitution reaction

1）Glu的羧基發(fā)生親核取代反應，與底物的異頭碳C1生成共價鍵，在此過程中，Glu163和Asp165因為位阻較大暫時無法形成氫鍵。

2）Asp165作為質子供體與異頭碳C1競爭性結合，由于位阻減小，因此Asp165和Glu163之間形成氫鍵，此時Glu163發(fā)生酸堿催化，導致水分子的電離。

3）Glu163和Asp165之間的低位阻氫鍵得以恢復，Glu163的親核取代基保持負電的狀態(tài)，并且開始準備參與新一輪的催化反應。

ι-卡拉膠酶的反應機制是通過一步親核取代作用于β-1，4糖苷鍵，同時還發(fā)生轉糖基和轉變異構構型，因此該酶的催化機制為倒置型。這種相互作用機制主要體現(xiàn)在糖鏈上β-螺旋在凹槽上進行移動，形成一種酶-底物結合的開放式復合物；隨著酶解過程的進行，該結構折疊閉合，其目的是保證糖鏈降解之后不會脫離酶的作用位點，使得催化反應能夠繼續(xù)進行。

Barbeyron等研究了ι-卡拉膠酶的降解機制，發(fā)現(xiàn)該酶是通過一步親核取代作用于β-1，4糖苷鍵，同時還發(fā)生了轉糖基和轉變異構構型，其水解產物主要是硫酸化新ι-卡拉二糖[66]。Potin等對水解產物進行了分析，發(fā)現(xiàn)該酶降解ι-卡拉膠的方式是通過異頭碳構象倒置，作用于其內部的β-1，4糖苷鍵，有別于κ-卡拉膠酶的保持型[102]。這種相互作用機制主要體現(xiàn)在糖鏈上β-螺旋在凹槽上進行移動，形成一種酶-底物結合的開放式復合物；隨著酶解過程的進行，該結構折疊閉合，其目的是保證糖鏈降解之后不會脫離酶的作用位點，使得催化反應能夠繼續(xù)進行（見圖6）。

圖6 ι-卡拉膠酶通過單置換反應降解卡拉膠的倒置機制Fig.6 Inversion mechanism of ι-carrageenase degradation of carrageenan via a monosubstitution reaction

2.5 卡拉膠酶的應用

目前，卡拉膠已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等多方面的工業(yè)生產中。研究表明，降解后的卡拉膠具有抗凝血、抗腫瘤、增強人體體液免疫和細胞免疫，以及抗病毒等多方面生物活性[7]。通過酶解法降解卡拉膠，反應過程和條件易于控制且不破壞糖鏈結構，因此酶解法受到了越來越多的關注?？ɡz酶是酶解過程中所需要的酶，因其具有底物的專一性，研究卡拉膠酶具有深遠的應用價值和理論意義。

2.5.1 制備卡拉膠寡糖據報道的卡拉膠寡糖及其修飾后的衍生物具有很多功能的生物活性。郭丹等通過酶解法制備了低相對分子質量的卡拉膠，隨后進行磺化修飾，獲得了具有不同硫酸基含量的卡拉膠寡糖衍生物，發(fā)現(xiàn)新κ-卡拉膠寡糖具有顯著的抗腫瘤活性，并證明了其空間結構、相對分子質量以及硫酸基團的含量和存在位置都會影響卡拉膠衍生物的生物活性[3]。又比如2019年，陳夢等通過酶解法和醇沉法，并與KCl溶液混合，以此獲得高結合率的低相對分子質量的κ-卡拉膠鉀（LCP），結果表明，LCP對自發(fā)性高血壓大鼠有穩(wěn)定且持續(xù)的降壓作用，此外，還顯著降低血液中脂多糖的水平（P＜0.05），并顯著改善了腸道上皮結構的完整性，該研究填補了LCP在心腦血管疾病領域的空白[103]。另外，卡拉膠寡糖還表現(xiàn)出抗氧化、抗血栓、增強免疫的作用[104-106]。

2.5.2 用于海藻遺傳工程由于卡拉膠主要存在于紅藻細胞壁中，其黏度很大，DNA提取困難。因此，可以通過卡拉膠酶和其他酶共同作用來降解海藻細胞壁，用于提取DNA、蛋白質和原生質體等物質。

1995年，F(xiàn)leurence等通過使用不同的酶來降解細胞壁從而提取蛋白質，不同的酶與不同的海藻的反應均在最適反應條件下進行，結果表明，用纖維素酶與卡拉膠酶或瓊脂酶結合使用，在2 h內可獲得最高產量的蛋白質。該實驗證明了多糖類的酶可以有效幫助降解細胞壁從而獲得目的產物[107]。Zablackis等通過纖維素酶與卡拉膠酶的協(xié)同作用，從Kappaphycus alvarezii中分離出來原生質體[108]。

2.5.3 研究卡拉膠的結構卡拉膠是具有重復二糖單元的線性硫酸化多糖，因此可以通過卡拉膠酶水解其中糖苷鍵獲得低聚卡拉膠，通過產物的結構分析來推測卡拉膠多糖的內部結構。Guibet等通過λ-卡拉膠酶來降解卡拉膠，并通過核磁共振技術研究寡糖產物，結果表明，λ-卡拉二糖單元中并不都含有3個硫酸基團，而是在部分單元中存在4個硫酸基團，該實驗結果改變了人們先前所知的λ-卡拉膠結構特征[109]。Antonopoulos等通過重組ι-卡拉膠酶降解ι-卡拉膠，然后用高效液相色譜法進行分離，結合蒸發(fā)光散射測定ι-卡拉膠寡糖的結構[110]。

2.5.4 其他應用針對卡拉膠獨特的生物活性，可以通過發(fā)酵改造的工程菌株獲取重組卡拉膠降解酶，該重組酶的特點是為外切酶，專一識別單位僅為六糖，并且表現(xiàn)出抗阿爾茲海默癥的活性[111]。此外，卡拉膠酶對于海藻廢物處理的應用也引起越來越多的關注[37]。最后，有研究指出，以κ-卡拉膠為原料，經脫硫、專一降解酶系的定向水解及菌種發(fā)酵，從而實現(xiàn)其乙醇轉化，獲得可工業(yè)生產的生物乙醇，這一途徑在未來將會極大程度上緩解不可再生資源的供給壓力[112]。

3 硫酸化酶的研究

卡拉膠的生物降解涉及卡拉膠酶和硫酸化酶，前者裂解糖苷鍵，后者催化去除硫酸鹽。盡管大量的卡拉膠酶已被描述，但只確定了少數(shù)硫酸化酶的生物化學特征。它們都是在海洋細菌中觀察到的，但從紅藻基因組的分析中還沒有預測到硫酸化酶[113]。

根據序列同源性、晶體結構和機制，硫酸化酶被分為4類。I型硫酸化酶或依賴甲酰甘氨酸的硫酸化酶，包括絕大多數(shù)已知的硫酸化酶，以及迄今為止所有生化特性的碳水化合物硫酸化酶[114]。這個家族的成員是依賴α-甲酰甘氨酸（fgly-dependent）的酶，含有10個高度保守的極性殘基，參與硫酸鹽識別和硫酸酯水解[19]。該家族最明顯的特征是其中一個極性殘基半胱氨酸（Cys）或絲氨酸（Ser）經過翻譯后將轉化為具有催化活性位點的醛殘基（α-Fgly殘基）[114]。

II型硫酸化酶包括依賴于α-酮戊二酸的Fe（II）烷基硫酸化酶，屬于雙加氧酶超家族[115]。該酶的催化作用需要分子氧（O2）和α-酮戊二酸作為共同底物，導致醛中的初級硫酸酯基團被氧化，同時導致α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸。III型硫酸化酶的代表是與Zn2+或Mn2+依賴性金屬-β-內酰胺酶有關的酶[116]。

IV型硫酸化酶指一個由非特征蛋白質組成的分支家族。其中具有代表性的酶是來自Pseudoalteromonas carrageenovora的ι-卡拉膠硫酸化 酶 （PSC ι-CgsA）。 研 究 表 明， 位 于P.carrageenovora的κ-卡拉膠酶產生的低聚κ-卡拉膠非還原端上的硫酸酯基團被特異性地消除，這表明硫酸化酶在κ-卡拉膠的酶解后進行干預[117-118]。Weigl等首次證明了從海洋細菌P.carrageenovora中獲得了具有活性的卡拉膠硫酸化酶[119]。2014年，Genicot等純化并表征了該酶。PSC ι-CgsA的相對分子質量為115 9 00，在pH 8.3和溫度為（40±5）℃時表現(xiàn)出最佳的活性和穩(wěn)定性。序列分析表明，PSC ι-CgsA與P.haloplanktis TAC 125的一個假定的非特征蛋白質Q3IKL4具有90%以上的序列同源性，但除此之外，與已鑒定的硫酸化酶沒有任何同源性，因此PSC ι-CgsA做為代表了一個新的硫酸化酶家族的第一個特征化成員[120]。

近來，學者對能夠降解卡拉膠的菌株Pseudoalteromonas atlantica T6c進行了類似的研究，其基因組已經被測序[121]。一種對ι-卡拉膠有活性的內切ι-卡拉膠硫酸化酶被分離出來，并進行了生物化學鑒定。該酶特異性地去除β-連接的半乳糖第4位的硫酸鹽，導致ι-卡拉二糖重復單元轉化為α-卡拉二糖重復單元（見圖7中B）[4，122]。編碼硫酸化酶的基因已被克隆并在大腸桿菌中重組表達。這些實驗證明，內切-4S-ι-卡拉膠硫酸化酶是一種I型硫酸化酶，一種依賴甲酰甘氨酸的硫酸化酶。

另一種卡拉膠硫酸化酶是從P.atlantica T6c中分離出來的，但它催化κ-卡拉二糖單元的脫硫作用，產生中性的β-卡拉二糖重復單元（見圖7）。這種內切-κ-卡拉膠硫酸化酶在大腸桿菌中的過度表達也驗證了其在I型硫酸化酶家族中的分組[123]。結果表明，此類型的酶與第一種卡拉膠硫酸化酶的調查相反，此類型的酶是對聚合物發(fā)揮作用，而不是寡糖。這表明卡拉膠的降解可能遵循不同的途徑，即一種途徑是在寡糖卡拉膠脫硫之前卡拉膠的解聚，另一種途徑是假設多糖的脫硫是在尚未發(fā)現(xiàn)的α-和β-卡拉膠酶降解α-或β-卡拉膠之前。

圖7 在卡拉膠的生物合成和生物降解過程中觀察到的卡拉膠硫酸化酶Fig.7 Carrageenan sulphatase observed in the biosynthesis and biodegradation of carrageenan

4 卡拉膠酶與硫酸化酶協(xié)同作用降解卡拉膠

由于卡拉膠是高度硫酸化的多糖，去除硫酸基團是實現(xiàn)卡拉膠完全分解所必需的。有研究證實，來自海洋異養(yǎng)細菌Zobellia galactinovorans中卡拉膠的完整分解代謝途徑已被表述（如圖8）。結果表明，Z.galactinovorans中的GHs和硫酸化酶對卡拉膠的降解具有協(xié)同作用。在這里，ι-和κ-卡拉膠需要由兩個專門的硫酸化酶對D-半乳糖的C4硫酸基進行脫硫，從而產生α-或β-卡拉膠。對于α-卡拉膠將通過第3種硫酸化酶將其轉化為β-卡拉膠，此過程是從脫水半乳糖中去除C2硫酸鹽基團[124]。如果沒有這些脫硫處理，低聚卡拉膠的進一步的降解步驟將會停止。具體步驟如下：

圖8 來自海洋異養(yǎng)細菌Zobellia galactinovorans中卡拉膠的完整分解代謝途徑Fig.8 Complete metabolic pathway of carrag eenan from the marine heterotrophic bacterium Zobellia galactinovorans

1）卡拉膠多糖的降解 ι-卡拉膠的降解是由GH82家族的ι-卡拉膠酶將多糖鏈裂解成更小的寡糖。而在κ-卡拉膠中，則是由GH16家族的一個κ-卡拉膠酶完成的。

2）低聚體卡拉膠上的G4脫硫 低聚體ι-卡拉膠需要由S1_19家族的ι-卡拉膠G4S-硫酸化酶對D-半乳糖殘基進行脫硫，從而產生低聚體α-卡拉膠。同樣的步驟發(fā)生在κ-卡拉膠中，在這里，一個κ-卡拉膠G4S-硫酸化酶水解了在D-半乳糖殘基上的硫酸酯，結果產生了非硫酸化的β-卡拉膠。

3）α-卡拉膠的脫硫 為了將α-卡拉膠轉化為非硫酸化的β-卡拉膠，需要用S1_17家族的α-卡拉膠DA2S-硫酸化酶對剩余的3，6-脫水-D-半乳糖殘基進行脫硫。

4）β-卡拉膠的降解 未硫酸化的β-卡拉膠可以被GH127或GH129家族的3，6-脫水-D-半乳糖苷酶或GH2家族的β-半乳糖苷酶從非還原端繼續(xù)連續(xù)降解。

5 展望

卡拉膠作為一種從海洋紅藻的細胞壁提取出的多糖物質，具有廣闊的應用價值和發(fā)展?jié)摿?。其已被證明具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗病毒、抗凝血等。降解后的卡拉膠及其分子修飾后的衍生物在某些方面已經展現(xiàn)出更強的生物活性。但由于目前所了解的卡拉膠分子修飾主要集中在構效方面，對于分子修飾的方法研究較少，因而在對卡拉膠進行設計改性從而獲得高活性、高穩(wěn)定性以及具有特定功能的卡拉膠衍生物仍然是今后的研究方向[8]。

卡拉膠多糖的酶降解需要卡拉膠酶和硫酸化酶的共同作用?？ɡz酶的來源主要依靠于海洋細菌。但由于海洋環(huán)境的復雜性和特殊性，目前對海洋細菌的了解還遠遠不夠。迄今為止，已有許多關于卡拉膠酶得到了分離純化的報道，并且對其中的基因進行了克隆表達，但仍未能滿足工業(yè)化生產與

應用的要求。其中一部分原因是缺乏相應的基因信息或者表達出來的酶具有過低的活性以及較差的穩(wěn)定性。田琳曾通過優(yōu)化κ-卡拉膠酶的發(fā)酵條件，使其酶活回收率高達72.4%，為其工業(yè)化生產打下基礎[125]。因此，在以后的研究中仍然需要重點分析卡拉膠酶的基因序列以及優(yōu)化表達條件[126-127]。而卡拉膠硫酸化酶的多樣性在于卡拉膠多糖的多樣性。其中卡拉膠硫酸化酶大部分的組成和結構都是未知的。因此，要全面分析硫酸化酶的功能，需要同時獲得關于卡拉膠多糖的新數(shù)據。揭示海洋生物來源多糖中硫酸化酶和其他酶的轉化過程，這將增強對海洋生物的分子層面理解。相信隨著基因組學的不斷進步以及科研技術的不斷發(fā)展，將會實現(xiàn)卡拉膠多糖以及其他海洋類能源物質的可持續(xù)發(fā)展。