梁克偉, 李 明, 王 猛

(中國(guó)刑事警察學(xué)院， 遼寧沈陽(yáng) 110035)

新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)指紋技術(shù)對(duì)脫落細(xì)胞DNA提取的影響

梁克偉, 李 明, 王 猛

(中國(guó)刑事警察學(xué)院， 遼寧沈陽(yáng) 110035)

采用痕跡檢驗(yàn)鑒定技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新開(kāi)發(fā)的新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)非滲透性客體表面的指紋，對(duì)指紋中脫落細(xì)胞的DNA進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)指紋后脫落細(xì)胞DNA提取成功率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的粉末方法。

DNA; M48磁珠提取DNA法; 指紋; YVO4:Eu納米熒光材料

0 引言

人類(lèi)的指紋具有明顯的個(gè)體特征,除少數(shù)沒(méi)有指紋的人,指紋將一生不變,可以廣泛應(yīng)用于刑事案件和身份管理等領(lǐng)域。指紋提取包括:顯現(xiàn)指紋、找到特征點(diǎn)、保存數(shù)據(jù)和比對(duì),其中顯現(xiàn)清晰的指紋是最關(guān)鍵的步驟。痕跡檢驗(yàn)鑒定技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新開(kāi)發(fā)的新型YVO4:Eu納米熒光材料，應(yīng)用于一系列常見(jiàn)的光滑非滲透性客體以及某些滲透性客體表面汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)。通過(guò)紫外燈照射觀察，顯現(xiàn)的紋線清晰連貫、細(xì)節(jié)特征明顯、對(duì)比反差強(qiáng)烈，其顯現(xiàn)效果沒(méi)有受到背景花紋圖案的干擾，保證了手印顯現(xiàn)的高靈敏度[1]。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究顯示： 由于摩擦和接觸，指紋中也存在表皮脫落細(xì)胞,有報(bào)道稱(chēng)人體手掌只要在非滲透性載體上接觸超過(guò)5秒鐘,就會(huì)有脫落細(xì)胞遺留。傳統(tǒng)的指紋顯現(xiàn)方法顯示指紋后由于顯現(xiàn)的顆粒大小對(duì)于后期DNA提取有不同程度的影響,而先提取指紋中的脫落細(xì)胞擦拭過(guò)程中又會(huì)破壞了指紋紋理，現(xiàn)場(chǎng)勘查人員常常進(jìn)退兩難，在辦案中需要找到一種既能顯示指紋又能對(duì)后期提取DNA影響較小的技術(shù)方法，以解決實(shí)戰(zhàn)需要。本實(shí)驗(yàn)先用YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)非滲透性客體表面的指紋，然后對(duì)指紋中脫落細(xì)胞DNA進(jìn)行提取，結(jié)果顯示新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)指紋后提取DNA明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的熒光粉末方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本采集

在非滲透性客體載玻片上指紋捺印樣本105份，每位參試者將手洗干凈后自然晾干，在干凈的載玻片表面按捺兩枚新鮮的汗?jié)撝讣y，指紋力度保證能夠做出DNA,待用。用干凈的鸛毛刷(必須一次性使用，而且不能重復(fù)使用防止交叉污染)蘸取微量新型YVO4:Eu納米熒光材料粉末，在客體表面可能有手印部位輕微掃動(dòng)，出現(xiàn)手印紋線后，彈掉毛刷上多余的粉末，順著紋線的流向刷顯至紋線清晰為止。將顯出的手印樣品置于暗箱式紫外分析儀中觀察、拍照記錄，再用指紋膠帶紙?zhí)崛」潭╗1]。

受試者另一份指紋末顯現(xiàn)直接用棉簽擦拭提DNA做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 使用YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)玻璃客體表面汗?jié)撌钟≌掌浩渲?a)為明場(chǎng)照片；(b)為紫外光照射下的暗場(chǎng)照片

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

M48磁珠DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN)；2 mg/mL蛋白酶K溶液(冰凍保存)；Identifiler?Plus Kit試劑盒(美國(guó)ABI公司)；9700型擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；3130XL型基因分析儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 M48磁珠法方法提取DNA

每份實(shí)驗(yàn)對(duì)象指紋檢材分別取YVO4:Eu納米熒光材料粉末顯示和未顯示各1份，分別放入0.5 mL離心管中，離心管加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K溶液(冰凍保存，10 mg/mL)，漩渦震蕩15 s，保證樣本與裂解液充分混勻，56 ℃恒溫烘箱水浴中消化2～3 h(期間取出震蕩5次)；高速離心機(jī)13 000 r/min離心3 min；轉(zhuǎn)移上清液到1.5 mL離心管中；加入1 mLMTL和30 μL磁珠，混勻，置于磁力電動(dòng)攪拌架上搖勻吸附15 min；然后磁力架吸附磁珠，棄去上清液后加入500 μL LMW1溶液搖勻，磁力架吸附磁珠去上清；加入500 μL80%的乙醇溶液搖勻，磁力架吸附磁珠去上清；重復(fù)75%乙醇洗滌2次，磁力架吸附磁珠棄上清；將離心管開(kāi)蓋置于65 ℃加熱塊上烘干；加入20 μL超純水混勻磁珠，65 ℃加熱10 min，期間震蕩2～3次；將離心管置于磁力架上吸附磁珠，取上清液置于新管中4 ℃保存待擴(kuò)增用[2]。

1.4 STR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

將上述兩種方法提取的模板DNA分別取適量DNA，用Identifiler?Plus Kit試劑盒試劑，PCR反應(yīng)體系9+1 μL進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物3130XL型基因分析儀進(jìn)行電泳[2]，STR對(duì)照樣本和顯示樣本STR分型圖譜分別見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 對(duì)照樣本檢材DNA分型

圖3 YVO4:Eu納米熒光顯現(xiàn)后檢材DNA分型

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

105例受試者未顯現(xiàn)指紋經(jīng)M48磁珠法直接提取DNA獲得了STR分型；新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)后的指紋經(jīng)M48磁珠法也獲得了STR分型，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 討論

我們以前曾經(jīng)研究發(fā)表過(guò)(詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)5)常見(jiàn)的金粉、銀粉和磁粉顯現(xiàn)后對(duì)指紋中脫落細(xì)胞DNA提取的影響研究，雖然常規(guī)的物理粉末顯現(xiàn)方法不會(huì)破壞細(xì)胞，但是由于上述3種粉末直徑比較大，消化提取DNA時(shí)由于一部分粉末覆蓋了脫落細(xì)胞導(dǎo)致無(wú)法充分消化， DNA測(cè)序峰值每次結(jié)果不穩(wěn)定，常常表現(xiàn)為大片段基因座位點(diǎn)容易丟失，公安實(shí)戰(zhàn)中操作難度較大[5]。從表1中我們可以看到未顯現(xiàn)指紋和顯現(xiàn)指紋都有STR分型，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選的非滲透性客體(載玻片)顯現(xiàn)的和未經(jīng)顯現(xiàn)的對(duì)照的指紋捺印樣本，經(jīng)過(guò)M48磁珠法提取DNA都能夠獲得STR分型結(jié)果，由此可見(jiàn)，新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)該類(lèi)檢材未對(duì)檢材的DNA含量及檢出造成影響。但是表中全部顯示基因位點(diǎn)(16個(gè)基因座)在成功率(比率)上略有差異，未顯現(xiàn)指紋(對(duì)照組)有10例未能顯示全部基因座可能是受試對(duì)象按壓指紋時(shí)分泌脫落細(xì)胞個(gè)體差異，納米熒光材料顯現(xiàn)后的指紋(實(shí)驗(yàn)組)有15例未顯示出全部基因座，我們分析除個(gè)體因素影響外，可能是由于操作原因，未能全部捕獲脫落細(xì)胞，YVO4:Eu納米熒光材料顯示完指紋后收集脫落細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法還有待改進(jìn)。

表1 105例脫落細(xì)胞樣本顯示與未顯示 指紋DNA提取成功率比較

從DNA測(cè)序儀圖譜的峰值結(jié)果來(lái)看(見(jiàn)圖2和圖3)，經(jīng)過(guò)新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)檢材樣本DNA的含量比較未經(jīng)顯示的對(duì)照樣本沒(méi)有明顯差異，峰值略低有可能是YVO4:Eu納米熒光材料本身提取DNA時(shí)占用了消化體積,導(dǎo)致模版相對(duì)濃度降低。

通常認(rèn)為紫外燈的照射破壞了細(xì)胞中DNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增模板堿基形成嘧啶二聚體(TT、CC和CT)，影響了DNA復(fù)制[6]，但是本研究由于指紋中脫落細(xì)胞被YVO4:Eu納米熒光材料覆蓋，遮擋了紫外線的照射，所以未發(fā)現(xiàn)對(duì)DNA模版的影響(雖然納米材料覆蓋了指紋中的脫落細(xì)胞，但顯示指紋后仍要盡量減少紫外線照射的時(shí)間)。在實(shí)驗(yàn)中為了獲得理想的STR分型，提取階段盡量避免細(xì)胞的丟失，盡可能收集載玻片上YVO4:Eu納米熒光粉末放入1.5 mL離心管中(先把載玻片粉末用干凈毛刷轉(zhuǎn)移到稱(chēng)量紙上，然后把稱(chēng)量紙折疊緩慢加入離心管中)。按照擴(kuò)增試劑盒規(guī)定DNA模板為1 μL，電泳結(jié)果峰值很低[4]，建議改為2 μL，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)通常為28次，建議增加兩個(gè)循環(huán)，達(dá)到30個(gè)循環(huán)次數(shù)，但是增加PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)不宜過(guò)多，因?yàn)檠h(huán)次數(shù)的增加意味著雜帶幾率的增加。

手印粉末顯現(xiàn)法原理是利用手中的汗液、油脂等遺留物質(zhì)有電負(fù)性和黏性，與粉末之間形成較強(qiáng)的物理性吸附力，由于手印遺留物質(zhì)上吸附了粉末，潛在手印紋路得以顯現(xiàn)出來(lái)[3]。采用YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)手印，如圖所示紅色熒光增強(qiáng)手印和客體背景之間的對(duì)比，進(jìn)而在很大程度上提高手印顯現(xiàn)的靈敏度。另外，YVO4:Eu納米熒光材料與傳統(tǒng)的粉末顯現(xiàn)指紋方法比較具有顆粒粒徑小、比表面積大、吸附能力適宜等特點(diǎn)，能夠促進(jìn)手印物質(zhì)與納米粉末之間的吸附[1]，這種吸附也把脫落細(xì)胞(DNA)進(jìn)行了包裹。傳統(tǒng)的粉末顯現(xiàn)指紋方法粉末顆粒粒徑較大，不利于DNA提取[5]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)新型YVO4:Eu納米熒光材料顯現(xiàn)的指紋樣本仍可以考慮通過(guò)DNA檢驗(yàn)獲得理想的STR分型，尤其對(duì)于非滲透性客體，如果顯示指紋得到的個(gè)體特征點(diǎn)不夠，便無(wú)法利用指紋檢驗(yàn)技術(shù)比對(duì)嫌疑人，這時(shí)可考慮利用DNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)嫌疑人或認(rèn)定嫌疑人，把指紋和DNA兩大個(gè)體識(shí)別技術(shù)聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用，對(duì)于實(shí)際辦案固定犯罪證據(jù)鏈，最大限度開(kāi)發(fā)現(xiàn)場(chǎng)物證的偵查價(jià)值具有非常重要的意義。

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(責(zé)任編輯 陳小明)

中國(guó)刑事警察學(xué)院痕跡檢驗(yàn)鑒定技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2015開(kāi)放課題研究成果。

梁克偉 (1967—)，男，遼寧沈陽(yáng)人，副教授，博士。研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)DNA和司法精神病鑒定。

D918.91