胡國恒劉 侃尹美美葛臻略

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

·研究報(bào)告·

腎腦復(fù)元湯對MCAO大鼠腦保護(hù)作用及cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的影響*

胡國恒1△劉 侃2尹美美2葛臻略2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

目的探究腎腦復(fù)元湯對MCAO大鼠腦保護(hù)作用，探討其腦保護(hù)機(jī)制與cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表達(dá)的關(guān)系。方法72只SD大鼠造模成功后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組，根據(jù)治療后處死時(shí)間每組再隨機(jī)分為3、7、14 d 3個亞組，比較各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積，并采用Western blot法檢測各組腦組織cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較顯示，中藥組較模型組有明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；腦梗死體積比較顯示，中藥組在各時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積均明顯小于模型組 （P＜0.01）；中藥組3、7、14 d腦組織cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)均低于模型組 （P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論腎腦復(fù)元湯能促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，減小腦梗死體積，其機(jī)制可能通過抑制線粒體cyt-C釋放，減少Caspase-9、Caspase-3表達(dá)發(fā)揮對MCAO大鼠腦保護(hù)的作用。

腦保護(hù) 腎腦復(fù)元湯 細(xì)胞色素C Caspase-9 Caspase-3

缺血性中風(fēng)又稱腦梗死，是指各種原因所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一種疾?。?］。線粒體作為能量工廠為細(xì)胞活動提供必要能量，同時(shí)還具有傳遞電子、貯存鈣離子、抗氧化等重要生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著中心調(diào)控作用，可以通過調(diào)控細(xì)胞色素C（cyt-C）的釋放，激活半胱氨酸-門冬氨酸特異蛋白酶（Caspase）通路，掌控著細(xì)胞的生存或死亡［1-2］。腎腦復(fù)元湯具有補(bǔ)腎益氣、活血祛瘀的功效，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎腦復(fù)元湯能通過抑制炎癥因子釋放，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能，從而起到腦保護(hù)作用［3-4］。本研究擬從腎腦復(fù)元湯對cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表達(dá)的影響，探討腎腦復(fù)元湯對MCAO大鼠腦保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量（260±20）g，斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司提供，許可證號：SYXK（湘）2011-0003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK（湘）2009-0001。

1.2 試藥與儀器 腎腦復(fù)元湯：熟地黃10 g，黃芪30 g，山茱萸10 g，山藥15 g，川芎10 g，紅景天20 g，丹參10 g，牡丹皮10 g，赤芍10 g，當(dāng)歸尾10 g，地龍10 g。所用藥物均為道地藥材，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。采用自動煎藥壺煎煮，煎煮方法：第一煎加水500 mL，煎取200 mL湯汁；第二煎加水300 mL，煎取150 mL湯汁；2次湯藥混合后置于60℃水浴鍋內(nèi)蒸發(fā)濃縮至含生藥2 g/mL，待冷卻后置于4℃冰箱冷藏備用。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（索萊寶生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司），cyt-C兔抗多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Caspase-9兔抗多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Caspase-3兔抗多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；DYYBC型電泳儀（北京市六一儀器廠），GAS7301B型凝膠成像分析系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司）。

1.3 造模方法 采用改良Zea Longa線栓法制作大鼠MACO模型［5］。動物禁水、禁食24 h后用10%水合氯醛（0.35 mL/100g）腹腔注射麻醉。頸前皮膚剪毛后以絡(luò)合碘消毒，從腹側(cè)頸部正中切開皮膚，往右下方分離頸部肌肉及筋膜，暴露頸總動脈；沿頸總動脈向上分離頸內(nèi)動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈。頸總動脈剪一小孔，用專用線栓調(diào)整好角度后緩慢插入頸內(nèi)動脈約20 mm處，稍有阻力時(shí)停止。大腦中動脈阻斷成功2 h后采用Zea Longa5分制進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分值在1~3分者為造模成功。假手術(shù)組麻醉后僅分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，不插線，不結(jié)扎血管。實(shí)驗(yàn)中使用恒溫墊加溫，電子體溫計(jì)監(jiān)測，使大鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。

1.4 分組及給藥 所有SD大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、中藥組，各組再根據(jù)處死時(shí)間分為3、7、14 d 3個亞組，每個亞組8只大鼠。造模24 h后，假手術(shù)組、模型組予灌胃等量蒸餾水，中藥組予腎腦復(fù)元湯灌胃。大鼠灌胃中藥劑量根據(jù)成人每日服用145 g生藥劑量進(jìn)行體表面積比值換算［6］，灌藥體積均為20 mL/kg，每日灌胃1次。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)已證明本方中藥劑量因素對藥效的影響無顯著性差異，因此實(shí)驗(yàn)中只選用臨床常規(guī)使用的中藥劑量。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 1）神經(jīng)功能缺損評分：各組于造模后2 h及處死前采用改良大鼠神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評分量表（m-NSS）［7］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，各指標(biāo)評分3次取均值納入結(jié)果。2）腦梗死體積測定：大鼠處死后迅速取出腦組織，從前囟前2 mm處，每隔2 mm做一冠狀切片，共切取5個層面。將切片浸泡于2%TTC溶液中，37℃，30 min，每5分鐘輕輕震蕩數(shù)次。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算每片腦組織梗死面積，總梗死體積=總梗死面積×腦片厚度（2 mm），并通過修正公式計(jì)算腦梗死體積百分比：梗死體積百分比（%）=［總梗死體積-（梗死側(cè)半球體積-梗死對側(cè)半球體積）］/梗死對側(cè)半球體積×100%。3）腦組織cyt-C，Caspase-9及Caspase-3蛋白表達(dá)：Western blot法檢測，取各組凍存于-80℃冰箱的腦組織，加入細(xì)胞裂解液后采用超聲勻漿15 min，離心5 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。各組取上清制備 50 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)NC膜，分別加入cyt-C，Caspase-9，Caspase-3一抗抗體，37℃孵育2 h；TBST洗膜3次，分別加入辣根酶標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液顯色。以β-action作為內(nèi)參計(jì)算各組cyt-C，Caspase-9，Caspase-3條帶的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。結(jié)果示，兩組在各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分與治療前比較均有下降（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組在給藥后第3、7、14天神經(jīng)功能缺損評分與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較下降更顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較（分，s）

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較（分，s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

?

2.2 各組腦組織梗死體積比較 見圖1，圖2。結(jié)果示，給藥3 d后中藥組腦梗死體積小于模型組（P＜0.05）；給藥7 d及14 d后，中藥組腦梗死體積明顯小于模型組（P＜0.01）。

2.3 各組不同時(shí)間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 見表2，圖3。結(jié)果示，假手術(shù)組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均差別不大（均P＞0.05），模型組、中藥組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于假手術(shù)組（均P＜0.01）。組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較顯示，模型組、中藥組第3、7、14天cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)逐漸降低，組內(nèi)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)組間比較顯示，中藥組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均低于模型組，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 第7天各組大鼠腦組織TTC染色

圖2 各組腦組織梗死體積比較與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 各組不同時(shí)間段cyt-C，Caspase-9，Caspase-3蛋白表達(dá)比較

3 討 論

缺血性中風(fēng)是以腦動脈硬化為基礎(chǔ)，以神經(jīng)功能缺損為主要表現(xiàn)的腦血管疾病，是我國目前三大致死致殘疾病之一［7］。中醫(yī)學(xué)對缺血性中風(fēng)的病因病機(jī)早有認(rèn)識，認(rèn)為情志、痰瘀、氣虛、毒邪以及臟腑虧虛均可導(dǎo)致中風(fēng)。《靈樞·經(jīng)脈篇》曰“髓與腦，皆精之類，精成而腦髓生”。說明腦為髓海，由腎精充盈匯聚而成，證實(shí)了腎與腦的化生關(guān)系。病機(jī)上《素問·逆調(diào)論》認(rèn)為“腎不生，則髓不能滿”。說明腎氣虧虛，髓海失養(yǎng)，是導(dǎo)致腦病的基本病機(jī)?；谌缟侠碚摶A(chǔ)，本課題組提出“從腎治腦、腎腦同治”理論，在補(bǔ)陽還五湯基礎(chǔ)上化裁而成腎腦復(fù)元湯，具有補(bǔ)腎益氣、活血祛瘀的功效，在臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)中均取得良好效果［8-9］。

表2 各組不同時(shí)間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)比較（s）

表2 各組不同時(shí)間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)比較（s）

與假手術(shù)組同時(shí)間比較，**P＜0.01；與模型組同時(shí)間比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與本組治療第3天比較，&P＜0.05，&&P＜0.01。

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腎腦復(fù)元湯藥物組成主要有熟地黃、山茱萸、山藥、黃芪、紅景天、牡丹皮、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、丹參、川芎。方中以熟地黃、黃芪為君藥，熟地黃能養(yǎng)陰填精益髓，黃芪能大補(bǔ)元?dú)?，兩者合用，精聚而生髓，氣行則瘀去。山藥補(bǔ)脾胃而養(yǎng)氣陰，山茱萸益肝腎而填精髓，共為臣藥；山茱萸與熟地黃合用助其補(bǔ)養(yǎng)肝腎，取“肝腎同源”之意。牡丹皮、赤芍、紅景天、當(dāng)歸尾皆為活血之藥，且以丹皮、赤芍之涼血活血制山茱萸之性溫，以當(dāng)歸尾養(yǎng)血活血之力助黃芪補(bǔ)氣行血之功，紅景天既能健脾益氣，又可活血化瘀，以上4味皆為佐藥。地龍入經(jīng)絡(luò)能搜風(fēng)邪，入血脈能行氣血，帥諸藥通行全身，活血通絡(luò)。全方諸藥合用，共奏補(bǔ)腎益氣、活血祛瘀之效。

中風(fēng)數(shù)小時(shí)內(nèi)，腦組織被快速摧毀，大約每分鐘有190萬個神經(jīng)元因缺血缺氧發(fā)生凋亡，同時(shí)有140億個神經(jīng)突觸壞死［10］。線粒體的變化是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，細(xì)胞凋亡過程中的多個重要程序都與線粒體密切相關(guān)，其中包括cyt-C的釋放及Caspase家族的激活［11］。Cyt-C位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，在線粒體受損后釋放分泌到細(xì)胞質(zhì)中，啟動細(xì)胞凋亡機(jī)制，是哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因素［12］。Caspase家族蛋白以非活性酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，通過逐級活化蛋白水解，獲得生物活性，促進(jìn)凋亡進(jìn)程［13］。研究表明，釋放到細(xì)胞質(zhì)的cyt-C與Apaf-1結(jié)合后形成Apaf-1-cyt-C復(fù)合體，其氨基酸CARD與Caspase-9酶原的CARD相互作用后形成復(fù)合體，在ATP的協(xié)助下活化Caspase-9酶原［14］，活化的Caspase-9進(jìn)一步激活Caspase-3。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白，特異性地加速凋亡進(jìn)程［15］。由此可見，神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷后，線粒體受損，導(dǎo)致cyt-c的釋放，并激活Caspase-9及Caspase-3是引起中風(fēng)后細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

本研究顯示，中藥組在給藥后第3、7、14天神經(jīng)功能缺損評分與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較均有下降，腦梗死體積在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯小于模型組，說明腎腦復(fù)元湯具有明確的腦保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腎腦復(fù)元湯能抑制線粒體cyt-C釋放，減少大鼠腦組織Caspase-9及Caspase-3的活化表達(dá)，是其減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，保護(hù)腦細(xì)胞的潛在機(jī)制之一。

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Effect of Shennao Fuyuan Decoction on Cerebral Protection and Cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 Expression in MCAO Rats

HU Guoheng，LIU Kan，YIN Meimei，et al.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To investigate the cerebral protection effect of Shennao Fuyuan decoction，find out its relation with the regulation of cyt-C，Caspase-9，and Caspase-3 expression.Methods：72 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group，model group，traditional Chinese medicine group（TCM group）.According to the executing time of 3，7，14 days，rats in each group were divided into three subgroups.Comparison of Neurological Severity Scores（NSS），volume of cerebral infarction among these groups was made.Western blot was used to explore the expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3.Results：In comparison of NSS scores at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.In comparison of infarct volume at every time point，TCM groups were much lower than model groups；there were significant statistical differences between the two groups（P＜0.01）.In comparison of protein expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Shennao Fuyuan decoction can promote the recovery of neurological function；decrease the infarct volume in MCAO rats.This cerebral protection effect is probably related to restraining the release of cyt-C in mitochondria，and reducing the expression of Caspase-9，Caspase-3.

Cerebral protection；Shennao Fuyuan decoction；Cyt-C；Caspase-9；Caspase-3

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0384-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.003

2016-12-08）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273751，81573941）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B315，CX2015B326）

△通信作者（電子郵箱：hugh9198@163.com）