占美錦張簫簫殷曉威嚴(yán) 羽任煒煒蔣衛(wèi)民

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

·研究報(bào)告·

清肝滋腎中藥對(duì)高脂喂養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)的影響*

占美錦1張簫簫1殷曉威1嚴(yán) 羽1任煒煒1蔣衛(wèi)民2△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

目的觀察清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）對(duì)高脂喂養(yǎng)的自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)及肝細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)的影響。方法18只4周齡雄性SHR大鼠，隨機(jī)分為正常飲食對(duì)照組（普通飼料+安慰劑）、高脂飲食模型組（高脂飼料+安慰劑）及清肝滋腎中藥組（高脂飼料+針箭顆粒Ⅱ號(hào)），每組大鼠均為6只，干預(yù)8周后取各組大鼠肝臟組織，采用Western blotting法檢測(cè)Sirt1及其裂解酶Caspase1蛋白的表達(dá)，并分別進(jìn)行HE染色、油紅O染色觀察肝臟細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)情況。結(jié)果與正常飲食對(duì)照組相比，高脂飲食模型組Sirt1蛋白表達(dá)降低，Caspase1表達(dá)水平顯著增高 （P＜0.001）；與高脂飲食模型組相比，清肝滋腎中藥組Sirt1蛋白表達(dá)水平升高，Caspase1表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。HE染色及油紅O染色顯示高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量脂肪浸潤(rùn)，清肝滋腎中藥組脂滴密度和大小較高脂模型組均有顯著降低。結(jié)論清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）能顯著上調(diào)高脂喂養(yǎng)SHR大鼠肝臟組織Sirt1蛋白的表達(dá)，顯著減輕SHR大鼠的肝臟脂肪浸潤(rùn)，從而在改善高血壓相關(guān)代謝障礙中發(fā)揮重要作用。

高血壓 高脂 清肝滋腎 Sirt1

高血壓是一種以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高為特征的進(jìn)行性“心血管綜合征”。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)改變，臨床中高血壓合并不同程度、形式的代謝紊亂越來(lái)越常見，帶來(lái)的心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)也明顯增高［1-3］，但其發(fā)生機(jī)制還不十分明確。Sirt1是一種NAD+依賴的組蛋白脫乙?；鞍酌?，研究表明，它能參與體內(nèi)眾多蛋白酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)，發(fā)揮改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖脂代謝，干預(yù)代謝紊亂的作用［4-5］。Caspase1作為一類蛋白裂解酶能在高脂飲食等誘發(fā)的炎癥發(fā)應(yīng)過程中被激活，并通過選擇性剪切Sirtl，使Sirt1表達(dá)下調(diào)［6-7］。清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）的前期研究已證實(shí)在穩(wěn)定血壓的同時(shí)，具有改善胰島素抵抗、糖脂異常等高血壓相關(guān)代謝紊亂的作用［8-9］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察其對(duì)高脂誘導(dǎo)SHR大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)及脂肪浸潤(rùn)的影響來(lái)探討清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）改善高脂誘導(dǎo)的SHR大鼠代謝紊亂的作用機(jī)制，為臨床進(jìn)一步拓展其應(yīng)用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只4周齡雄性SHR大鼠，體質(zhì)量（102.50±5.54）g，購(gòu)自北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑 大鼠普通飼料由南京中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心提供，高脂飼料 （Rodent diet with 60%kcal fat irradiated）、0.5%纖維素鈉安慰劑均由南京普克泰生物技術(shù)中心提供，清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)，由鬼針草、鬼箭羽、玄參等6味組成）由江蘇省中醫(yī)院制劑室供應(yīng)。GAPDH、羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司），Sirt1（武漢三鷹13161-1-AP），ECL檢測(cè)試劑盒、全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、Western blotting檢測(cè)試劑盒、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒、預(yù)染蛋白分子量、麗春紅染色液、蘇木素-伊紅染液試劑盒及FBS（江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司），顯色液、定影液（無(wú)錫市靈琦服務(wù)用品廠）。

1.3 分組與造模 18只4周齡雄性SHR大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后（6周齡），隨機(jī)分成3組，即正常飲食對(duì)照組、高脂飲食模型組、清肝滋腎中藥組，每組大鼠均為6只。正常飲食對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)及等劑量的0.5%纖維素鈉安慰劑，高脂飲食模型組予高脂飼料喂養(yǎng)及等劑量的0.5%纖維素鈉安慰劑，清肝滋腎中藥組給予高脂飼料及針箭顆粒［（22.5 g/（kg·d）］混懸液2 mL進(jìn)行灌胃，共灌胃8周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 灌胃結(jié)束后，處死大鼠提取肝臟組織，冰水浴中冷0.9%氯化鈉溶液沖洗，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋備用。另取8 mm×8 mm肝臟組織置于10%中性甲醛溶液中固定，OCT包埋后，制成4~ 5 μm冷凍切片行油紅 O染色。1）肝組織Sirt1及 Caspasel蛋白表達(dá)的檢測(cè)。取凍存的肝組織，切成小塊，加入FBS均液沉淀，吸取上清放入Buffer緩存液反復(fù)離心后提取胞漿蛋白和核蛋白，用Braford法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)要求制膠，取適量待測(cè)樣品蛋白加入染液中測(cè)定OD值，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，凝膠上鋪上NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)模，再加入5%脫脂奶粉室溫封閉1~2 h，用TBST洗膜10 min×3次，加入含一抗的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，TBST洗10 min×3次。二抗室溫?fù)u床震蕩1~2 h后，TBST洗膜10 min×3次，最后顯影成像，使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，GAPDH作內(nèi)參照。2）蘇木精-伊紅（HE）染色制片檢測(cè)肝臟的病理變化。取實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織石蠟切片按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟，水合，將切片用二甲苯浸泡5 min，更換二甲苯后再浸泡5 min；分別用無(wú)水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，PBS浸洗3 min×3次；根據(jù)蘇木素-伊紅染液試劑盒 （中國(guó)江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司KGA224）操作步驟完成染色過程。3）油紅O染色制片檢測(cè)肝臟的病理變化。取新鮮肝臟組織制成冰凍切片，厚度4~5 μm；將標(biāo)本置入60%異丙醇中浸10 min；入油紅O染液中浸染，室溫3~4 h；入60%異丙醇分化至背景無(wú)色；自來(lái)水沖洗1~3 min；蘇木素復(fù)染；再予自來(lái)水沖洗1~3 min；甘油明膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 清肝滋腎中藥對(duì)高脂喂養(yǎng)SHR大鼠肝臟組織Sirt1和Caspase1蛋白表達(dá)的影響 見表1、圖1。與正常飲食對(duì)照組相比，高脂飲食模型組肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)明顯下降，Caspase1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001）；與高脂飲食模型組比較，清肝滋腎中藥組肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)上調(diào)，Caspase1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

表1 清肝滋腎中藥對(duì)高脂喂養(yǎng)SHR大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達(dá)的影響（s）

表1 清肝滋腎中藥對(duì)高脂喂養(yǎng)SHR大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達(dá)的影響（s）

與正常飲食對(duì)照組比較，*P＜0.001；與高脂飲食模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n Sirt1/GAPDH Caspase1/GAPDH正常飲食對(duì)照組 6 0.617±0.021 0.070±0.010高脂飲食模型組 6 0.143±0.047*0.570±0.095*清肝滋腎中藥組 6 0.303±0.081△0.173±0.086△

圖1 各組大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達(dá)電泳條帶

2.2 肝臟組織HE染色、油紅O染色結(jié)果 見圖2。HE染色光鏡觀察正常飲食對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索整齊，核結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)明顯病理改變；高脂飲食模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細(xì)胞脂肪變性、沉積，呈大泡樣改變；清肝滋腎中藥組中亦可見脂肪浸潤(rùn)及脂肪空泡，但較高脂飲食模型組程度明顯減輕。正常飲食對(duì)照組大鼠肝臟沒有脂肪沉積，而高脂飲食模型組大鼠肝臟組織可見密集的脂滴，顯示大量脂肪浸潤(rùn)，而清肝滋腎中藥組脂滴密度和大小較高脂飲食模型組均有顯著降低，表明清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）干預(yù)后可顯著改善肝臟脂肪沉積。

圖2 各組SHR大鼠肝臟組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

高血壓是最常見的一種心腦血管疾病，以往多單純將其歸為血流動(dòng)力學(xué)異常疾病范疇，隨著對(duì)其病機(jī)認(rèn)識(shí)的深入，明確其發(fā)生發(fā)展與肥胖、血脂異常、高血糖、胰島素抵抗等代謝紊亂之間存在著密切的關(guān)系。眾多研究也證實(shí)，在高血壓患者人群中單純高血壓患者只占少數(shù)，絕大多數(shù)高血壓均合并有不同形式的代謝紊亂［10］。因此，新的防治策略中，在強(qiáng)調(diào)降壓達(dá)標(biāo)的同時(shí)，更重視已明顯發(fā)生或存在潛在發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的與高血壓密切相關(guān)的各種代謝紊亂，從而最大程度地降低高血壓患者的心腦血管風(fēng)險(xiǎn)。肝臟組織是調(diào)控機(jī)體糖脂代謝的重要組織器官，也是糖脂代謝紊亂的靶器官，研究表明，高脂飲食及肥胖可通過慢性炎癥、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)沉積等機(jī)制引起肝臟、肌肉等組織中出現(xiàn)脂肪的異位累積，導(dǎo)致機(jī)體糖脂等代謝紊亂［11-13］，沉默調(diào)節(jié)蛋白1（Sirt1）屬于一類具有多種生理功能的蛋白去乙?；福诓溉閯?dòng)物的肝臟、脂肪組織、肌肉等多種器官、組織中廣泛表達(dá)，其與SIR2的同源性最高，也是近年來(lái)Sirtuins家族成員中得到最深入研究的一項(xiàng)，在人體內(nèi)，Sirt1通過調(diào)控多種控制代謝和胰島素信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)參與體內(nèi)眾多生理功能的調(diào)節(jié)，在糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、胰島素分泌等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［14-16］。即機(jī)體可通過升高或降低Sirt1表達(dá)水平，來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而起到影響物質(zhì)代謝平衡的作用。清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）是導(dǎo)師蔣衛(wèi)民教授基于對(duì)高血壓相關(guān)代謝紊亂的中醫(yī)基本病因病機(jī)的探索，對(duì)既往已被基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)可以明確改善高血壓相關(guān)代謝障礙的針箭顆粒組方的進(jìn)一步優(yōu)化，并通過本研究進(jìn)一步探討其改善高血壓代謝紊亂的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過分析高脂飲食SHR大鼠和正常飲食SHR大鼠及清肝滋腎中藥干預(yù)后的大鼠肝臟組織Sirt1蛋白的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)與正常飲食對(duì)照組比，高脂飲食模型組Sirt1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，其裂解酶Caspase1蛋白表達(dá)升高（P＜0.001），與高脂飲食模型組相比，清肝滋腎中藥干預(yù)后肝臟組織Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，Caspase1蛋白表達(dá)也出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），提示清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號(hào)）可能通過抑制Caspase1活性，上調(diào)Sirt1蛋白表達(dá)，而發(fā)揮其改善高血壓相關(guān)代謝紊亂的作用，但其作用的確切機(jī)制還待今后的研究中設(shè)計(jì)Sirt1基因敲除相關(guān)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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Effect of Qinggan Zishen Chinese Medicine on Sirt1 Protein Expression in Liver Tissue of Spontaneously Hypertensive Rats Fed with High Fat Diet

ZHAN Meijin，ZHANG Xiaoxiao，YIN Xiaowei，et al.Nanjing U-niversity of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210000，China.

Objective：To investigate the effect of Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）on the expression of Sirt1 protein in liver tissue and fatty infiltration in hepatocytes of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet.Methods：Eighteen male SHR aged 4 weeks were randomly divided into the normal diet group（normal diet+placebo），the high-fat diet model group（high fat diet+placebo）and the Qinggan Zishen herbs group（high fat diet+Zhenjian granuleⅡ）.After 8 weeks of intervention，the liver tissues of rats were taken，and the expression of Sirt1 and Caspase1 protein was detected by Western blotting method，and the fatty infiltration of hepatocytes was observed by HE staining and oil red O staining respectively.Results：Compared with the normal diet group，the expression of Sirt1 protein in the high-fat diet model group was lower，and the expression level of Caspase1 was significantly higher（P＜0.001）.Compared with the high-fat diet model group，the Qinggan Zishen herbs group increased the expression level of Sirt1 protein，the expression level of Caspase1 was decreased obviously（P＜0.05）.HE staining and oil red O staining showed that the liver tissue structure disorder and large amount of fat infiltration were caused by high fat diet，and the density and size of lipid droplet in the Qinggan Zishen herbs group were significantly lower than those of the high-fat diet model group.Conclusion：Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）can significantly raise the expression of Sirt1 protein in liver tissue of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet，and markedly reduce the fatty infiltration of liver in SHR rats，and thus playing an important role in improving hypertension-related metabolic disorders.

Essential hypertension；High fat；Qinggan Zishen herbs；Sirt1

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0381-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.002

2016-12-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（81373605）；江蘇省中醫(yī)藥局資助課題（LZ13030）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

△通信作者（電子郵箱：jwm0410@163.com）