肖雪飛，李經(jīng)輝，張翔，鄒楊鴻，黃鷂，余化霖

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

干細(xì)胞與自體星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

肖雪飛，李經(jīng)輝，張翔，鄒楊鴻，黃鷂，余化霖

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

脊髓損傷(SCI)是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病，采用外科手術(shù)、藥物治療效果不佳。干細(xì)胞療法可以有效修復(fù)損傷脊髓，但因?yàn)榇嬖趥惱淼赖碌南拗埔约懊庖吲懦狻⒓?xì)胞移植繼發(fā)損傷和潛在致瘤性等難以解決的問(wèn)題，目前研究進(jìn)展緩慢。自體細(xì)胞重編程技術(shù)通過(guò)在體內(nèi)重編程內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得成神經(jīng)細(xì)胞，補(bǔ)充神經(jīng)元，以促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)通路再生和脊髓功能恢復(fù)。該技術(shù)可能為SCI的治療帶來(lái)突破性進(jìn)展。

脊髓損傷；干細(xì)胞；星形膠質(zhì)細(xì)胞；重編程

脊髓損傷(SCI)是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病，具有高發(fā)病率、高耗費(fèi)的特點(diǎn)，對(duì)患者身心健康和社會(huì)福利產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前臨床上對(duì)SCI的干預(yù)很大程度上是姑息性治療及后期康復(fù)治療，患者的癥狀或許有一定改善，但預(yù)后卻不佳。近年來(lái)研究結(jié)果證明，干細(xì)胞療法在修復(fù)損傷脊髓和重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路上擁有極大潛力，在臨床應(yīng)用卻存在諸多困難[2]。最新研究提出，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子可以在體內(nèi)將自體星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為微管相關(guān)蛋白(DCX)陽(yáng)性的成神經(jīng)細(xì)胞，并可以在體內(nèi)誘導(dǎo)分化為成熟的功能性神經(jīng)元[3，4]。這為SCI的治療提供了一個(gè)全新的方向。本文針對(duì)干細(xì)胞及自體星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)治療SCI的研究進(jìn)展作一綜述。

1 SCI的特征

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)于SCI的認(rèn)識(shí)程度也在不斷加深。目前認(rèn)為SCI的病理生理變化主要分為三個(gè)階段：第一階段，原發(fā)性機(jī)械損傷直接造成脊髓組織結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致部分神經(jīng)細(xì)胞死亡。第二階段，脊髓組織完整性被破壞，由于血管的損傷，造成出血、缺血、血管通透性變化，局部組織發(fā)生水腫、缺血、壞死；細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基釋放增加，神經(jīng)元大量破壞、崩解；中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、興奮性細(xì)胞毒性和不明機(jī)制的神經(jīng)元凋亡程序啟動(dòng)，造成大量神經(jīng)元死亡。第三階段，神經(jīng)元持續(xù)凋亡，損傷部位出現(xiàn)不同程度的脫髓鞘病變和脊髓空洞，膠質(zhì)瘢痕形成并產(chǎn)生抑制因子影響神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)[2]。目前臨床中對(duì)SCI主要運(yùn)用外科手術(shù)、藥物、康復(fù)等治療，可以減輕繼發(fā)性損傷，減少膠質(zhì)瘢痕形成，促使神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，在短期內(nèi)可以得到一定程度的治療效果，但中遠(yuǎn)期預(yù)后均不理想，其原因在于目前的治療方法均不能使丟失的神經(jīng)元得到補(bǔ)充，也不能完全消除膠質(zhì)瘢痕形成的物理屏障，脊髓功能不能得到完全恢復(fù)[1，5]。

2 干細(xì)胞療法

干細(xì)胞療法是近年的研究熱點(diǎn)，相對(duì)傳統(tǒng)治療方法，干細(xì)胞治療擁有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)移植干細(xì)胞并在體內(nèi)分化以補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元使神經(jīng)通路得以修復(fù)，促使脊髓功能恢復(fù)。

2.1 干細(xì)胞的種類(lèi)及功能

2.1.1 胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSCs) ESCs是來(lái)源于早期胚胎的干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)可以無(wú)限增殖，并具有自我更新和多向分化的特性。iPSCs運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4 、c-Myc)導(dǎo)入體細(xì)胞，使其重編程得到的在遺傳表觀和功能上類(lèi)似于ESCs的具有多向分化潛能的干細(xì)胞[6]。已有研究表明，移植ESCs和iPSCs在體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)能夠逆轉(zhuǎn)SCI后局部不利的微環(huán)境，在體內(nèi)遷移分化，有效補(bǔ)充損傷脊髓內(nèi)丟失的包括神經(jīng)元在內(nèi)的各種神經(jīng)細(xì)胞，重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，達(dá)到修復(fù)脊髓的目的[7～9]。

2.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) MSCs是非神經(jīng)源類(lèi)型的多能干細(xì)胞，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有跨越譜系分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力[10，11]，大量用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。目前用于SCI治療相關(guān)研究的MSCs主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和臍血干細(xì)胞等。研究表明，在SCI模型中，植入MSCs表現(xiàn)出明顯的免疫抑制作用，減輕局部炎癥反應(yīng)。同時(shí)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促使內(nèi)源性NSCs增殖、分化，并促使損傷灶血管增生，發(fā)揮促神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，達(dá)到治療SCI的效果[12～14]。

2.1.3 NSCs NSCs是神經(jīng)系統(tǒng)中的一類(lèi)具有自我維持和自我更新能力的單能干細(xì)胞，能夠在體內(nèi)增殖并分化為不同神經(jīng)細(xì)胞。脊髓中內(nèi)源性NSCs來(lái)源主要為分布于脊髓中央管的室管膜細(xì)胞。SCI后，室管膜細(xì)胞迅速分裂增殖，分化成大量星形膠質(zhì)細(xì)胞和部分少突膠質(zhì)細(xì)胞，極少分化為神經(jīng)元[15]。移植外源性NSCs進(jìn)入脊髓后其存活率較低，存活下來(lái)的細(xì)胞也主要向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。Lu等[16]通過(guò)向移植部位填充部分纖維蛋白支架和神經(jīng)生長(zhǎng)因子以增加NSCs的存活率，大約1/3的NSCs最后分化成神經(jīng)元，并與宿主神經(jīng)元形成突觸連接。另有研究表明，植入NSCs可以誘導(dǎo)脊髓內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)血管生成，使肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[17]。

2.2 干細(xì)胞治療SCI的缺陷 現(xiàn)階段研究表明，干細(xì)胞移植治療SCI在理論上可行，但實(shí)際臨床應(yīng)用存在困難。第一，運(yùn)用人體胚胎來(lái)源的ESCs或異體干細(xì)胞存在著難以避免的倫理道德和免疫排斥問(wèn)題[7]。第二，將自體細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)為iPSCs所需時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)錯(cuò)過(guò)SCI最佳治療時(shí)間窗[18]。第三，干細(xì)胞移植過(guò)程本身可能造成繼發(fā)損傷，或?qū)е戮植磕X脊液泄露、注入點(diǎn)囊性包裹形成等，都可能加重SCI。另外，干細(xì)胞移植于體內(nèi)還有潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)[19]。因此，將干細(xì)胞安全、可靠地用于SCI的臨床治療、發(fā)掘更合適來(lái)源的干細(xì)胞將是今后研究重點(diǎn)。

3 內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)

Takahashi等[6]發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、c-Myc、Sox2、Klf48重編程小鼠成纖維細(xì)胞獲得iPSCs。有學(xué)者用同樣方法將人源星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為iPSCs，發(fā)現(xiàn)可以獲得更高的誘導(dǎo)效率，并且得到的iPSCs也可以被引導(dǎo)分化為NSCs，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞可能具有較高的干細(xì)胞潛能[20]。Corti等[21]發(fā)現(xiàn)，Oct4、Sox2和Nanog可以將人類(lèi)大腦來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外直接編程為神經(jīng)干細(xì)胞，并且編程過(guò)程也可以在小鼠體內(nèi)完成。另有研究表明，通過(guò)慢病毒將轉(zhuǎn)錄因子Sox2導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，可以將內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為DCX陽(yáng)性的成神經(jīng)細(xì)胞，且可通過(guò)藥物干預(yù)分化為成熟的神經(jīng)元并整合到局部的神經(jīng)通路中[22]。Guo等[4]通過(guò)研究證實(shí)，在成年小鼠腦損傷后，用逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼NeuroD2神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子，可以將腦皮層增生的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞重新編程轉(zhuǎn)換成功能性神經(jīng)元，并可檢測(cè)到轉(zhuǎn)換來(lái)的神經(jīng)元突觸電生理信號(hào)。

目前針對(duì)內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為成神經(jīng)干細(xì)胞治療SCI的報(bào)道不多。Su等[23]發(fā)現(xiàn)，將轉(zhuǎn)錄因子Sox2通過(guò)慢病毒載體導(dǎo)入小鼠SCI模型中并表達(dá)，可以將神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的主要成分——星形膠質(zhì)細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄為可增殖的成神經(jīng)細(xì)胞。且腹腔注射組蛋白脫乙酰酶抑制劑促使新生神經(jīng)元成熟，形成γ-氨基丁酸中間神經(jīng)元，與先前的膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸連接。該研究在體內(nèi)將內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為成神經(jīng)細(xì)胞，并整合到脊髓神經(jīng)系統(tǒng)通路中，克服了干細(xì)胞移植所面臨的尷尬處境，為內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)治療SCI提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。

雖然目前暫時(shí)無(wú)星形膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)重編程技術(shù)存在負(fù)面效應(yīng)的報(bào)道，但已有學(xué)者指出，包括c-Myc、Oct4、Sox2在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子或基因在腫瘤細(xì)胞有表達(dá)，且直接或間接參與了腫瘤的發(fā)生過(guò)程，如在部分惡性腫瘤中c-Myc過(guò)表達(dá)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[24]。而目前常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在自然界中的宿主通常為人或其他脊椎動(dòng)物，擁有感染細(xì)胞并將遺傳信息整合到宿主基因的能力，可能會(huì)破壞腫瘤抑制基因的調(diào)節(jié)機(jī)制或激活原癌基因，存在潛在生物學(xué)危險(xiǎn)因素。因此，如何將星形膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)重編程技術(shù)安全用于SCI治療也是值得研究的課題。

SCI的病理生理變化是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，隨著對(duì)SCI不同階段分子機(jī)制理解的深入，越來(lái)越多的治療相關(guān)研究策略被提出。目前認(rèn)為SCI治療的關(guān)鍵在于：促進(jìn)神經(jīng)元再生和克服膠質(zhì)瘢痕的物理屏障。干細(xì)胞療法作為一種有前途的治療方式，在現(xiàn)有的研究中體現(xiàn)出了極高的潛力。雖然將干細(xì)胞療法運(yùn)用于臨床仍然存在爭(zhēng)議、風(fēng)險(xiǎn)及技術(shù)上的困難，但不可否認(rèn)其臨床運(yùn)用前景十分廣闊。而星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)作為一種全新的方法，相比以往的干細(xì)胞療法擁有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，首先使用內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重編程不存在倫理道德問(wèn)題和免疫排異反應(yīng)；其次星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而膠質(zhì)瘢痕的主要成分也是星形膠質(zhì)細(xì)胞，重編程的目的細(xì)胞來(lái)源廣泛，且重編程技術(shù)在膠質(zhì)瘢痕中重建神經(jīng)通路有很大潛力；相比以前的譜系編程技術(shù)(如iPSCs)，星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)干細(xì)胞的過(guò)程更加高效，且保持了相同的細(xì)胞譜系，其遺傳表觀相對(duì)穩(wěn)定；和干細(xì)胞植入相比，直接導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒致瘤風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，且植入病毒的體積相對(duì)更小，對(duì)脊髓組織的損傷更輕。雖然目前看來(lái)星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程技術(shù)可能存在風(fēng)險(xiǎn)，但這一發(fā)現(xiàn)對(duì)治療SCI有重大意義，希望在不久的將來(lái)這項(xiàng)技術(shù)能為SCI治療帶來(lái)突破性進(jìn)展。

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(責(zé)任編輯：2016-09-26)

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2013Y287)。

余化霖(E-mail：yuhl308@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.036

R744

A

1002-266X(2017)05-0107-03