孫金龍，韓樂天，張楠，郭瓊，連方，孫振高

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)博士研究生班，濟(jì)南250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3山東省婦幼保健院)

精漿彈性硬蛋白酶水平對(duì)IVF-ET正常受精、優(yōu)質(zhì)胚胎的影響

孫金龍1，2，韓樂天2，張楠2，郭瓊3，連方2，孫振高2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)博士研究生班，濟(jì)南250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3山東省婦幼保健院)

目的 探討精漿彈性硬蛋白酶對(duì)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)正常受精、優(yōu)質(zhì)胚胎的影響。方法 選擇因女方輸卵管因素行促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑長(zhǎng)方案卵巢控制性刺激的1 183對(duì)周期不孕夫婦。按照男性生殖系統(tǒng)感染情況將女性分為三組：未感染(精漿彈性硬蛋白酶水平<290 ng/mL)組703例、隱性感染(精漿彈性硬蛋白酶水平290～1 000 ng/mL)組385例、確證感染(精漿彈性硬蛋白酶水平>1 000 ng/mL)組95例。排除獲卵數(shù)≤5個(gè)或≥20個(gè)、女方年齡≥35歲，三組經(jīng)校正后未感染組159例、隱性感染組137例、感染組41例。均行IVF-ET，對(duì)比各組校正前后正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率。結(jié)果 校正前三組正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。校正后三組正常受精率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與隱性感染組、未感染組比較，感染組正常受精率降低(P<0.017)。結(jié)論 排除女方高齡、卵巢低反應(yīng)及卵巢高反應(yīng)人群，卵巢正常儲(chǔ)備女性其丈夫精漿彈性硬蛋白酶水平對(duì)IVF-ET正常受精率有影響，對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎率影響不大。

體外受精；精漿彈性硬蛋白酶；胚胎移植；優(yōu)質(zhì)胚胎；男性；生殖系統(tǒng)感染

男性隱性生殖系統(tǒng)感染對(duì)男性生育力有潛在的負(fù)面影響。精漿彈性硬蛋白酶是診斷男性生殖系統(tǒng)感染，特別是隱性感染的重要指標(biāo)之一。精漿彈性硬蛋白酶水平與精液中炎性細(xì)胞數(shù)呈正比[1]。炎性細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧(ROS)及分泌諸多細(xì)胞因子等方式損傷精子，破壞精子的正常功能和成熟過程。在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)發(fā)展過程中，男性精液的作用也越來越受到重視。本研究探討精漿彈性硬蛋白酶水平對(duì)IVF-ET正常受精、優(yōu)質(zhì)胚胎的影響，以期發(fā)現(xiàn)男性生殖系統(tǒng)感染對(duì)IVF-ET結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年6月～2016年6月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院行IVF-ET的1 183對(duì)夫婦。女方年齡18～41歲，不孕年限2～7年，原發(fā)不孕555例、繼發(fā)不孕628例，周期獲卵數(shù)1～43枚，胚胎培養(yǎng)隨機(jī)采用Irvine或Quinn′s培養(yǎng)液系統(tǒng)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①因女方輸卵管因素行IVF-ET，排除男女雙方泌尿生殖系統(tǒng)急性感染；②女方采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑長(zhǎng)方案卵巢控制性刺激并獲得卵子；③男方精液常規(guī)檢查無異常；④取卵前1～2個(gè)月，男性行精漿彈性硬蛋白酶檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排卵障礙；②子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病；③盆腔炎性疾病及其后遺癥。按照男性生殖系統(tǒng)感染情況[2]將女性分為三組：未感染(精漿彈性硬蛋白酶水平<290 ng/mL)組703例、隱性感染(精漿彈性硬蛋白酶水平290～1 000 ng/mL)組385例、確證感染(精漿彈性硬蛋白酶水平>1 000 ng/mL)組95例。排除獲卵數(shù)≤5個(gè)或≥20個(gè)、女方年齡≥35歲，三組經(jīng)校正后未感染組159例、隱性感染組137例、感染組41例。各組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入組前均簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率測(cè)算 采用密度梯度離心+上游法處理精子。以人絨毛膜促性腺激素10 000 U扳機(jī)后36 h取卵，體外培養(yǎng)4 h，調(diào)整精子密度至每個(gè)微滴精子懸液50 μL，精子按5 000～10 000條/卵子進(jìn)行調(diào)整，加入微滴與卵子共同培養(yǎng)16～18 h，在倒置顯微鏡下觀察受精情況，以見到原核(PN)或卵裂為受精成功的標(biāo)志。正常受精率=2PN受精卵/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率(分裂球期胚胎)=(Ⅰ級(jí)胚胎數(shù)+Ⅱ級(jí)胚胎數(shù))/卵裂數(shù)×100%[3]。胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《臨床診療指南：輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊(cè)》卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料三組比較使用多重比較列聯(lián)表Pearsonχ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步兩兩比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=2×0.05/3×(3-1)=0.017，P<0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組校正前正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 未感染組、隱性感染組、確證感染組正常受精率分別為61.78%(5 070/8 206)、63.00%(2 668/4 235)、62.58%(654/1 045)，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為41.94%(1 712/4 082)、42.24%(890/2 107)、41.78%(216/517)；三組正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 三組校正后正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較 未感染組、隱性感染組、感染組正常受精率分別為75.53%(1 321/1 749)、70.07%(1 056/1 507)、48.78%(220/451)，優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為56.32%(490/870)、54.98%(414/753)和55.51%(126/227)；三組校正后正常受精率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與隱性感染組、未感染組比較，感染組正常受精率降低(P<0.017)。

3 討論

精漿彈性硬蛋白酶是機(jī)體內(nèi)能水解彈性蛋白的酶，分布于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞中。當(dāng)存在男性生殖系統(tǒng)感染時(shí)，該酶被大量分泌至細(xì)胞外，與其他氧化物發(fā)揮局部抗炎性反應(yīng)。由于彈性硬蛋白酶是一種可溶性蛋白酶，在精液中均勻分布，對(duì)診斷男性生殖系統(tǒng)感染比精漿白細(xì)胞更加準(zhǔn)確。因此，精漿彈性硬蛋白酶是男性生殖系統(tǒng)感染，特別是隱性感染的重要診斷指標(biāo)之一[5]。精漿彈性硬蛋白酶升高為確診感染者，其白細(xì)胞總數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞數(shù)比未感染者增加[6]。由于其有效性和穩(wěn)定性，該酶作為靜止型生殖系統(tǒng)感染的診斷及預(yù)后監(jiān)察指標(biāo)，并得到WHO的推薦[2]。

精漿彈性硬蛋白酶升高導(dǎo)致正常受精率降低的原因有以下幾個(gè)方面：①?gòu)椥杂驳鞍酌概c精子單鏈DNA呈負(fù)相關(guān)，單鏈DNA精子在IVF-ET技術(shù)中其受精能力較差[7,8]。②由精漿彈性硬蛋白酶提示的生殖系統(tǒng)感染時(shí)，炎性細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生ROS及分泌多種細(xì)胞因子等途徑損傷精子的正常功能，包括正常的受精能力[9]。③精漿彈性硬蛋白酶水平升高可引起精子頂體酶活性的降低[10，11]，這其中的原因可能是由于炎性細(xì)胞及其產(chǎn)物引起的精子頂體膜被破損。而精子頂體酶活性降低與低受精率有關(guān)[12,13]。且有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)精液中白細(xì)胞>1×106/mL的且給予抗炎治療有效者，其精子頂體酶活性也隨之上升，再次證明精漿彈性硬蛋白酶可以影響精子頂體酶活性[14]。

本研究校正前未發(fā)現(xiàn)精漿彈性硬蛋白酶水平與體外受精率有差異。盡管文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于女性高齡、卵巢低反應(yīng)與高反應(yīng)對(duì)受精率的影響結(jié)論不一，但據(jù)我們臨床觀察以上幾種情況可能導(dǎo)致受精率降低甚至完全不受精，文獻(xiàn)中也有類似報(bào)道[15～17]。為進(jìn)一步證實(shí)，本研究排除獲卵數(shù)≤5個(gè)或≥20個(gè)、女方年齡≥35歲，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確證感染組的正常受精率低于未感染組、隱性感染組，優(yōu)質(zhì)胚胎率未見明顯差異；隱性感染組的正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率與未感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與IVF受精前精液的密度梯度離心+上游法處理有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道上游法篩選出的精子不僅具有較高的活力，具有完整頂體區(qū)域的橢圓形精子比例也相對(duì)增加[18]。同時(shí)，上游法還可顯著降低影響精子活力的指標(biāo)水平，如NO[19]。密度梯度離心法可將DNA斷裂和染色體濃縮差的精子進(jìn)行篩除，Erel等[20]認(rèn)為，經(jīng)密度梯度離心法處理后得到的精子頂體反應(yīng)率、低滲腫脹實(shí)驗(yàn)陽性率和和成熟比例均比上游法顯著提高。精液密度梯度離心+上游法結(jié)合應(yīng)用，提高了精子回收率，在精液處理過程中通過分子篩的離心作用及洗滌，可以有效去除精漿及精液中不利于受精的成分，如前列腺素、異性蛋白、抗精子抗體及各種非精子細(xì)胞成分，從而可以為受精提供更有利的環(huán)境。研究提示，精液密度梯度離心+上游法處理除可提高精子活力外，還可降低畸形精子比例，從而提高體外受精成功率[21]。

IVF-ET技術(shù)的禁忌證已有明確規(guī)定，但男性非急性生殖系統(tǒng)感染并非為其禁忌證。為保證IVF-ET技術(shù)成功率，有必要對(duì)男性非急性生殖系統(tǒng)感染給予關(guān)注及治療。常見的泌尿生殖道病原菌為非典型菌，無細(xì)胞壁的生理特性使內(nèi)酰胺類及糖肽類抗生素治療無效。抑制蛋白合成的抗生素治療效果比較理想[22,23]。治療期間應(yīng)注意避免無保護(hù)性生活，癥狀明顯或者明確檢出病原菌的患者，應(yīng)建議性伴侶同時(shí)規(guī)范治療。

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連方(E-mail：f_lian@163.com)

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R691.3

B

1002-266X(2017)05-0072-03

2016-11-24)