張震，劉海全，林一峰，唐漢武，宋振杰，王利仁

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

補(bǔ)腎壯督散水煎液對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)退變的影響及其機(jī)制

張震1，劉海全2，林一峰2，唐漢武2，宋振杰2，王利仁2

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

目的 探討補(bǔ)腎壯督散水煎液對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)退變的影響及其可能機(jī)制。方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎壯督散組、塞來(lái)昔布組，各10只。除假手術(shù)組外，其余各組均采用腰椎纖維環(huán)全層穿刺法制備腰椎間盤(pán)退變模型。造模第2天，補(bǔ)腎壯督散組和塞來(lái)昔布組分別給予補(bǔ)腎壯督散水煎液、塞來(lái)昔布膠囊水溶液灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。各組處死后取出椎間盤(pán)組織，HE染色后觀察病理變化，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色后透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，Western blotting法檢測(cè)椎間盤(pán)組織基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)蛋白表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次分明，與髓核界限分明；成纖維細(xì)胞呈梭條狀，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較發(fā)達(dá)。模型組椎間盤(pán)膠原纖維排列紊亂，與髓核界限消失；成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。補(bǔ)腎壯督散組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較分明，與髓核界限分明；成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稍不發(fā)達(dá)。塞來(lái)昔布組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較補(bǔ)腎壯督散組紊亂，與髓核界限欠分明；成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較不發(fā)達(dá)。假手術(shù)組椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.198±0.028，補(bǔ)腎壯督散組為0.525±0.056，塞來(lái)昔布組為0.809±0.029，模型組為1.065±0.055；各組椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高，組間兩兩比較P均<0.05。結(jié)論 補(bǔ)腎壯督散水煎液灌胃可延緩大鼠腰椎間盤(pán)退變；抑制腰椎間盤(pán)組織MMP-3表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

腰椎間盤(pán)退變；補(bǔ)腎壯督散；基質(zhì)金屬蛋白酶3；大鼠

腰椎間盤(pán)退變是導(dǎo)致腰背痛的主要原因之一[1]。腰椎間盤(pán)退變的基本病理變化是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在椎間盤(pán)ECM的降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MMP-3是椎間盤(pán)ECM降解的關(guān)鍵酶之一，其在退變的椎間盤(pán)組織中高表達(dá)[2]。2014年9月～2016年3月，本研究觀察了補(bǔ)腎壯督散水煎液對(duì)大鼠腰椎間盤(pán)退變的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，3月齡，體質(zhì)量(250±20)g，均購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2008A002。藥物及試劑：補(bǔ)腎壯督散(海馬5 g、鹿角膠10 g、黃芪30 g、熟地黃20 g、細(xì)辛4 g)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室制備成散劑，取溫開(kāi)水500 g沖溶，過(guò)濾去渣，蒸餾水調(diào)整定容至500 mL，藥物含量為1 g/mL，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ麃?lái)昔布膠囊購(gòu)于輝瑞制藥有限公司，水合氯醛購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，MMP-3兔多克隆抗體抗體(一抗)購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，羊抗兔二抗購(gòu)于丹麥Dako公司。電子顯微鏡購(gòu)于日本日立公司。

1.2 模型制備與分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎壯督散組、塞來(lái)昔布組，各10只。除假手術(shù)組外，其余各組均參考文獻(xiàn)[3]的方法采用腰椎纖維環(huán)全層穿刺法制備L5、6腰椎間盤(pán)退變模型，假手術(shù)組僅暴露椎間盤(pán)，不穿刺。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，每只大鼠肌注8萬(wàn)U青霉素，連續(xù)應(yīng)用3天。造模后第二天上午8時(shí)補(bǔ)腎壯督散組予補(bǔ)腎壯督散水煎液1 mL/100 g灌胃，塞來(lái)昔布組予塞來(lái)昔布膠囊水溶液1.25 mg/kg灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃；均為1次/d，連續(xù)8周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 椎間盤(pán)組織超微結(jié)構(gòu)及病理情況 術(shù)后8周每組隨機(jī)抽取5只，麻醉后處死，迅速取出L5、6椎間盤(pán)組織。以椎間盤(pán)中線為界，于損傷側(cè)椎間盤(pán)外纖維環(huán)取1 mm3的組織塊，置于30 g/L戊二醛緩沖液中固定24 h，加入10 g/L鋨酸固定2 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋。光鏡下定位后行超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色。于7 500倍電子顯微鏡下觀察椎間盤(pán)組織成纖維細(xì)胞和膠原纖維結(jié)構(gòu)。將剩余椎間盤(pán)組織置于4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋，4 μm厚切片，烘烤后二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，進(jìn)行HE染色。40倍光鏡下觀察椎間盤(pán)組織病理變化。

1.3.2 椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。術(shù)后8周將剩余5只大鼠的L5、6椎間盤(pán)組織置于玻璃研磨器中搗碎，裂解液裂解后充分勻漿。冰上裂解30 min，4 ℃條件下14 000 r/min離心5 min，取上清。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度合格后備用。10% SDS-PAGE凝膠恒壓電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶恒溫封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶20 000)進(jìn)行雜交。以GAPDH為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影、定影，采用Image J 軟件行MMP-3蛋白半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 椎間盤(pán)組織超微結(jié)構(gòu)及病理變化 椎間盤(pán)組織超微結(jié)構(gòu)：假手術(shù)組椎間盤(pán)組織束狀纖維平行排列，膠原纖維排列緊密，成纖維細(xì)胞呈梭條狀，外形較圓滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較發(fā)達(dá)。模型組椎間盤(pán)組織束狀纖維不完全孤立，膠原纖維排列較稀疏，成纖維細(xì)胞體型較小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。補(bǔ)腎壯督散組多數(shù)束狀纖維平行排列，膠原纖維排列較緊密，成纖維細(xì)胞外形不圓滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稍不發(fā)達(dá)。塞來(lái)昔布組束狀纖維間之間不完全孤立，膠原纖維排列稍稀疏，成纖維細(xì)胞外形不圓滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較不發(fā)達(dá)。椎間盤(pán)組織病理變化：假手術(shù)組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次分明，呈同心圓形，排列規(guī)則整齊，膠原走行清楚，與髓核界限分明。模型組部分纖維環(huán)破裂，椎間盤(pán)膠原纖維排列紊亂，與髓核界限消失。補(bǔ)腎壯督散組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較分明，呈同心圓形，與髓核界限分明。塞來(lái)昔布組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較補(bǔ)腎壯督散組紊亂，與髓核界限欠分明。2.2 椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白表達(dá) 假手術(shù)組椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.198±0.028，補(bǔ)腎壯督散組為0.525±0.056，塞來(lái)昔布組為0.809±0.029，模型組為1.065±0.055；各組椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高，組間兩兩比較P均<0.05。

3 討論

椎間盤(pán)是人體最早退變的器官，腰椎間盤(pán)退變最早可發(fā)生在10歲左右[4]。腰椎間盤(pán)退變是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，由多種因素共同參與，如遺傳因素、細(xì)胞代謝失衡、椎體結(jié)構(gòu)的改變、新生血管長(zhǎng)入、免疫炎癥等[5]。近年來(lái)，中藥復(fù)方治療腰椎間盤(pán)退變多有報(bào)道，其延緩腰椎椎間盤(pán)退變的作用也越來(lái)越受到關(guān)注[6～8]。補(bǔ)腎壯督散是一種具有溫腎強(qiáng)督作用的中藥復(fù)方；塞來(lái)昔布是臨床常用的環(huán)化酶2抑制劑，不僅可以消炎止痛，還能夠增加椎間盤(pán)組織中的蛋白多糖水平，降低軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)，延緩椎間盤(pán)退變[9]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組增生的膠原纖維排列紊亂，與髓核界限消失；成纖維細(xì)胞體型較小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不發(fā)達(dá)；說(shuō)明采用腰椎纖維環(huán)全層穿刺法制備腰椎間盤(pán)退變模型成功。本研究補(bǔ)腎壯督散組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較分明，與髓核界限分明，成纖維細(xì)胞外形不圓滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稍不發(fā)達(dá)；而塞來(lái)昔布組椎間盤(pán)纖維環(huán)層次較補(bǔ)腎壯督散組紊亂，與髓核界限欠分明，成纖維細(xì)胞外形不圓滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較不發(fā)達(dá)；兩組椎間盤(pán)組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變均較模型組輕。說(shuō)明補(bǔ)腎壯督散可以延緩大鼠腰椎間盤(pán)的退變，其效果優(yōu)于塞來(lái)昔布。

腰椎間盤(pán)退變的主要表現(xiàn)為細(xì)胞減少和ECM降解，而ECM的丟失是導(dǎo)致椎間盤(pán)力學(xué)特性喪失的主要原因，ECM的合成和降解失衡可直接導(dǎo)致腰椎間盤(pán)退變[10，11]。MMPs是最重要的一類(lèi)ECM分解蛋白酶，在腰椎間盤(pán)退變組織中表達(dá)顯著升高[12]。MMP-3在ECM的降解過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，不僅可以直接裂解膠原蛋白，還可以直接降解蛋白多糖和糖蛋白，更重要的是MMP-3還能激活其他潛在的MMPs，產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，發(fā)揮間接促ECM降解作用。MMP-3還能夠降解椎間盤(pán)組織的膠原蛋白和蛋白多糖。Jing等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在退變的髓核組織中MMP-3能夠抑制Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，加速腰椎間盤(pán)退變。本研究假手術(shù)組、補(bǔ)腎壯督散組、塞來(lái)昔布組、模型組椎間盤(pán)組織MMP-3蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說(shuō)明補(bǔ)腎壯督散延緩大鼠腰椎間盤(pán)退變的作用機(jī)制與其降低MMP-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎壯督散水煎液灌胃可通過(guò)降低椎間盤(pán)組織MMP-3表達(dá)而延緩大鼠腰椎間盤(pán)退變，但其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81574000)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(ZD06)。

林一峰(E-mail： lyf@gzucm.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.009

R681.53

A

1002-266X(2017)16-0033-03

2016-03-20)