張麗宏,安麗鳳,黃敬文,魯光寶,劉海洲,王佳娜,王英蓮,王興焱
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)
蒺藜皂苷對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞酪氨酸酶和小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
張麗宏,安麗鳳,黃敬文*,魯光寶,劉海洲,王佳娜,王英蓮,王興焱
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)
目的:在前期研究的基礎(chǔ)上,以蒺藜皂苷為研究對(duì)象,考察其對(duì)A375細(xì)胞酪氨酸酶活性、TYR和MITF mRNA的表達(dá)的影響。方法:采用不同濃度的蒺藜皂苷作用于A375細(xì)胞48 h后,應(yīng)用左旋多巴氧化法測(cè)定酪氨酸酶活性,熒光定量PCR法檢測(cè)A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:應(yīng)用蒺藜皂苷處理后,酪氨酸酶活性均有不同程度的增加,當(dāng)達(dá)到100 μg/mL和200 μg/mL時(shí),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TYR和MITF mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論:蒺藜皂苷可能通過增強(qiáng)A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá),以提高酪氨酸酶活性,促進(jìn)黑素合成,從而為蒺藜皂苷的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
蒺藜皂苷;酪氨酸酶;MITF
白癜風(fēng)(vitiligo)是世界性疑難雜癥之一,屬于色素減退性皮膚病,其皮損最初為小片色素減退或色素脫失的白斑,逐漸擴(kuò)大或融合,甚至波及全身[1-3]。雖不危及生命,但給患者造成了嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療白癜風(fēng),已有幾千年的歷史,取得了獨(dú)特的療效[4-5]。目前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者熱衷于治療白癜風(fēng)復(fù)方的組方規(guī)律研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒺藜是治療白癜風(fēng)各證型的常用中藥,并居于前列。蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(Tribulus terrestrisl)的果實(shí),具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目、止癢等方面的功效,已開發(fā)成多種制劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和保健領(lǐng)域。
本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),一定濃度的蒺藜皂苷能夠促進(jìn)人黑素瘤A375細(xì)胞的增值、黏附,從而促進(jìn)黑素合成,有望開發(fā)為治療白癜風(fēng)的中藥制劑。但其是否通過干預(yù)酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)?本課題組就此問題進(jìn)一步開展研究,從而闡明其作用機(jī)制,為后續(xù)開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1 主要儀器
倒置顯微鏡(CKX41-A32PH,日本Olympus);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(680,美國(guó)BIO-RAD);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F,蘇州工業(yè)園區(qū)三興凈化科技有限公司);CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC,日本三洋公司);Bio-Rad IQ5多色實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)Bio Rod公司)。
1.2 試劑與藥物
蒺藜皂苷(陜西森弗生物技術(shù)有限公司,純度≥90%);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季青公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(Takara寶生物工程大連有限公司)。
1.3 細(xì)胞株
人黑素瘤A375細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生物細(xì)胞研究所。
2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng)
將人黑素瘤A375細(xì)胞復(fù)蘇后,接種至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中,DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含1%青鏈霉素混合液,10%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺),調(diào)pH值7.2,放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi),隔日更換培養(yǎng)液,2~3天可傳代1次。傳代時(shí),先棄掉培養(yǎng)液,再加入適量胰蛋白酶消化,消化完全后,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,輕輕吹打至單細(xì)胞懸液。倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù),選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
2.2 分組及藥物處理
實(shí)驗(yàn)共分5組,分別為蒺藜皂苷不同濃度組和空白對(duì)照組。蒺藜皂苷組需加入終濃度分別為25、50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液(實(shí)驗(yàn)前用DMEM培養(yǎng)液配置)??瞻讓?duì)照組給予相同體積的 DMEM培養(yǎng)液。
2.3 酪氨酸酶活性的測(cè)定
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑素瘤A375細(xì)胞,接種到96孔板內(nèi),每孔加入細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液200 μl,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,更換培養(yǎng)液,蒺藜皂苷組分別加入終濃度50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液??瞻讓?duì)照組僅加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,PBS漂洗2次,每孔再加入1%的Trion X-100溶液100 μl(PBS溶,pH值6.8),快速于-80℃冷凍30 min,取出后置于室溫緩慢溶解,37℃預(yù)溫10 min后,每孔需再加入0.2%的左旋多巴溶液50 μl,反應(yīng)1 h,離心后在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值。每組設(shè)有6個(gè)復(fù)孔,測(cè)3次,最后取平均值。
2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)TYR和MITF mRNA表達(dá)
2.4.1 提取總RNA
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,更換培養(yǎng)液,蒺藜皂苷組分別加入終濃度50、100、200 μg/mL蒺藜皂苷溶液??瞻讓?duì)照組僅加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,分別收集細(xì)胞,提取總RNA(按Triozl抽提試劑說明書進(jìn)行),并進(jìn)行總RNA純度及濃度的測(cè)定。
2.4.2 引物序列
Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找TYR和MITF mRNA全基因序列,應(yīng)用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列見表1。
表1 TYR、MITF和β-actin引物序列
2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中cDNA的合成,按PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件:第一階段是預(yù)變性,選擇95℃預(yù)變性30 s,共1個(gè)循環(huán);第二階段是PCR反應(yīng),選擇95℃變性5 s,然后60℃退火20 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)用iQTM5軟件分析各樣本的Ct值。同時(shí)測(cè)定各樣本的熔解曲線,由熔解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。計(jì)算TYR和MITF mRNA的相對(duì)表達(dá)量,本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
3.1 不同濃度蒺藜皂苷對(duì)酪氨酸酶活性的影響
不同濃度的蒺藜皂苷溶液處理A375細(xì)胞48 h后,將裂解細(xì)胞后所得的上清液進(jìn)行處理,檢測(cè)A375細(xì)胞被蒺藜皂苷誘導(dǎo)后,細(xì)胞中相對(duì)酪氨酸酶的活性。由表1可知,與對(duì)照組比較,給藥組酪氨酸酶均有不同程度的增加,當(dāng)達(dá)到100 μg/mL和200 μg/mL時(shí),相對(duì)酪氨酸酶的活力分別為1.40和1.33,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
表2 The relatively total activity of tyrosinase of A375 treated with ASP(±s)
表2 The relatively total activity of tyrosinase of A375 treated with ASP(±s)
Note:To compare with the control group,*P<0.05,**P<0.01.
Groups(μg/mL)Total activity of tyrosinases Multiple Control 0.089±0.025 1.00 25 0.099±0.032 1.11 50 0.112±0.033 1.25 100 0.125±0.035**1.40 200 0.119±0.032*1.33
3.2 高濃度蒺藜皂苷對(duì)TYR和MITF mRNA表達(dá)的影響
3.2.1 總RNA、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析
提取A375細(xì)胞的總RNA,使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值均大于1.8,符合反轉(zhuǎn)錄要求。Fig.1~3顯示內(nèi)參基因(β-actin)和目的基因(TYR、MITF)的熔解曲線皆為一個(gè)峰,峰形尖而窄,無(wú)雜峰,提示本實(shí)驗(yàn)可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。Fig.4~6顯示內(nèi)參基因(β-actin)和目的基因(TYR、MITF)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,圖中顯示直線擬合度良好,可在較寬的范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析。
3.2.2 高濃度蒺藜皂苷對(duì)A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá)情況
將終濃度為100 μg/mL蒺藜皂苷作用于A375細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞并提取總mRNA,進(jìn)行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR檢測(cè)TYR和MITF mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,100 ug/mL蒺藜皂苷能增強(qiáng)TYR和MITF mRNA的表達(dá)(P<0.05)。具體見Fig.7。
白癜風(fēng)是臨床上色素減退性皮膚病中最常見的一種疾病,其病理特征為黑素細(xì)胞的選擇性破壞引起黑素合成減少[6-7]。黑素的合成受多種因素的調(diào)控,酪氨酸酶是在黑素合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶[8-9],MITF是關(guān)鍵的調(diào)控基因[10]。各種因素引起的人體黑素細(xì)胞酪氨酸酶活力下降、酪氨酸酶基因或MITF基因表達(dá)異常等均能降低黑素合成,從而導(dǎo)致色素減退性皮膚病。因此,改善酪氨酸酶活力、調(diào)控酪氨酸酶基因和MITF基因表達(dá)為眾多學(xué)者提供了研究路徑。
臨床上蒺藜具有較強(qiáng)的祛風(fēng)止癢的作用,在治療白癜風(fēng)方面取得獨(dú)特的療效,常與蟬蛻、荊芥等同用。但蒺藜的妙用在于對(duì)用量的掌握上,否則不會(huì)收到預(yù)期療效。《中國(guó)藥典》中記錄其常規(guī)用量是6~9 g,但臨床治療白癜風(fēng)時(shí),所用的劑量大多超過了《中國(guó)藥典》中的劑量。如劉復(fù)興[11]將白癜風(fēng)分為七個(gè)證型進(jìn)行治療,各型患者均使用了蒺藜,而且重用至60 g。
Fig.1 Melting curve of β-actin
Fig.2 Melting curve of TYR
Fig.3 Melting curve of MITF
Fig.4 Standard curve of β-actin
Fig.5 Standard curve of TYR
Fig.6 Standard curve of MITF
Fig.7 Effect of ASP on TYR and MITF mRNA expression in A375 cells
在實(shí)驗(yàn)中,不同濃度的蒺藜皂苷作用于A375細(xì)胞后,酪氨酸酶活性均有不同程度的增加,當(dāng)達(dá)到100 μg/mL和200 μg/mL時(shí),相對(duì)酪氨酸酶的活力分別為1.40和1.33,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明高濃度蒺藜皂苷具有增強(qiáng)A375細(xì)胞酪氨酸酶活性的作用。為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制,課題組采用熒光定量PCR法檢測(cè)A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,應(yīng)用高濃度蒺藜皂苷處理后,A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高濃度蒺藜皂苷可能通過增強(qiáng)A375細(xì)胞TYR和MITF mRNA的表達(dá),以提高酪氨酸酶活性,從而促進(jìn)黑素合成。課題組下一步將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做深入驗(yàn)證,以期為蒺藜皂苷的開發(fā)與應(yīng)用提供全面而可靠的依據(jù)。
[1]Ruiz-Villaverde R,Sánchez-Cano D.Can Vemurafenib Induce Vitiligo in Metastatic Melanoma Patients?[J].Balkan Med J,2016,33 (1):115-116.
[2]Bingül?,Ayd?ng?z?E,Vural P.The Evaluation of Endothelin-1 and Endothelin Receptor Type A Gene Polymorphisms in Patients with Vitiligo[J].Indian J Dermatol,2016,61(1):118.
[3]Meurer M,Schild M.Treatment of vitiligo[J].Hautarzt,2016,67 (3):249-264.
[4]曾文浩,屈保平,張星平,等.驅(qū)蟲斑鳩菊治療白癜風(fēng)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(2):96-101.
[5]楊穎,劉巧,胡俊媛,等.中藥天花粉對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)、增殖、周期和遷移的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(2):30-34.
[6]Rashighi M,Harris JE.Interfering with the IFN-γ/CXCL10 pathway to develop new targeted treatments for vitiligo[J].Ann Transl Med,2015,3(21):343.
[7]Iannella G,Greco A,Didona D.Vitiligo:Pathogenesis,clinical variants and treatment approaches[J].Autoimmun Rev,2016,15(4): 335-343.
[8]Al-Shobaili HA,Rasheed Z.Oxidized tyrosinase:A possible antigenic stimulus for non-segmental vitiligo autoantibodies[J].J Dermatol Sci,2015,79(3):203-213.
[9]Eby JM,Kang HK,Tully ST.CCL22 to Activate Treg Migration and Suppress Depigmentation in Vitiligo[J].J Invest Dermatol,2015,135 (6):1574-1580.
[10]Tuerxuntayi A,Liu YQ,Tulake A.Kaliziri extract upregulates tyrosinase,TRP-1,TRP-2 and MITF expression in murine B16 melanoma cells[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:166.
[11]潘莉虹,黃虹,劉復(fù)興.導(dǎo)師劉復(fù)興治療白癜風(fēng)經(jīng)驗(yàn)[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2006,27(1):4-5.
Effect of Thistle Saponins on TYR and MITF mRNA Expressions of A375 Cells
ZHANG Li-hong,AN Li-feng,HUANG Jing-wen*,LU Guang-bao,LIU Hai-zhou,WANG Jia-na,WANG Ying-lian,WANG Xing-yan
(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,China)
Objective:On the basis of the previous research,regarding thistle saponins as the research object,to study its tyrosinase activity,tyrosinase and MITF mRNA expressions of A375 cells.Methods:Different concentrations of thistle saponins were used for the A375 cells for 48 hours,and then the tyrosinase activity was evaluated by levodopa oxidation method.TYR and MITF mRNA expressions of A375 cells were detected by luorescence quantitative PCR.Results:After application of thistle saponins,the activity of tyrosine was increased to a certain degree.When it was up to 100 μg/mL and 200 μg/mL,there was a statistical significance.TYR and MITF mRNA expressions were obviously increased(P<0.05).Conclusion:Thistle saponins can improve the activity of tyrosinase by enhancing TYR and MITF mRNA expressions of A375 cell,so as to promote the synthesis of melanin,which lay a foundation for the development and application of thistle saponins.
Thistle saponins;Tyrosinase(TYR);MITF
R28
A
1002-2406(2017)02-0018-04
黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.QC2012C004);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(No.12531626);黑龍江省博士后資助課題(No.LBHZ13198)
張麗宏(1970-),女,副教授,主要從事中醫(yī)美容研究工作。
黃敬文*(1980-),男,副教授,博士,主要研究方向:色素障礙性皮膚病的臨床與基礎(chǔ)研究。
2016-04-06
修回日期:2016-05-01