孫超，董坤，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

木犀草苷對(duì)HUVECs抗氧化損傷保護(hù)作用研究

孫超，董坤，馬英麗*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:采用過(guò)氧化氫(H2O2)體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，構(gòu)建HUVECs氧化損傷模型，觀察蓬子菜中木犀草苷對(duì)損傷HUVECs的保護(hù)及損傷修復(fù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法:采用體外培養(yǎng)HUVECs，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞增殖到80%左右時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:空白組、模型組(僅加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h)，給藥保護(hù)組(質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25 mg/L的木犀草苷培養(yǎng)24 h，之后加入濃度為200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)2 h)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，熒光分光光度法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量;采用紫外分光光度法測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放。Hoechst33328熒光染色觀察木犀草苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果:與正常組比較，模型組培養(yǎng)液中LDH含量明顯增加;SOD，GSH-Px活性降低，MDA含量明顯升高(P均＜0.01)。與模型組比較，給藥各劑量組(6.25、12.5、25 mg/L)都能顯著提高H2O2損傷的細(xì)胞的存活率，明顯抑制HUVECs的LDH的釋放，顯著減少HUVECs的MDA的含量，提高SOD的活性。結(jié)論:蓬子菜木犀草苷對(duì)氧化損傷的HUVECs具有保護(hù)及修復(fù)作用。

蓬子菜;木犀草苷;氧化損傷

血管疾病的臨床學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞與血液的屏障不僅具分泌的功能，還參與血管生理學(xué)功能的調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是引起多種血管疾病(如心腦血管疾病，靜脈血栓等)的重要原因之一［1］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧被認(rèn)為是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要因素，因此抗氧化損傷方面的研究對(duì)治療心，腦血管疾病具有重要的意義［2-3］。在木犀草苷的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，木犀草苷有直接清除活性氧自由基的作用，能提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低過(guò)氧化物質(zhì)生成［4］，臨床上應(yīng)用木犀草苷治療下肢靜脈血栓取得了良好的療效［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外建立過(guò)氧化氫損傷模型，探討木犀草苷對(duì)HUVECs的保護(hù)、損傷及修復(fù)的作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 材料

木犀草苷(本實(shí)驗(yàn)室自提分離得到);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供);RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies Corporation);胰酶細(xì)胞消化液(碧云天生物技術(shù)研究所);CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);PBS(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);丙二醛MDA試劑盒、超氧化物歧化酶SOD試劑盒、乳酸脫氫酶LDH試劑盒、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶GSH-Px(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)BSC-1300IIB2(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force，HF90);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX41);電熱恒溫水浴鍋(HHS，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司，Synergy 2);套筒式微量冷凍離心機(jī)(天美科學(xué)儀器有限公司，MX-307);微孔濾膜(0.22 μm，AMRESCO公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK8酶標(biāo)法檢測(cè)不同濃度木犀草苷對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，不同濃度木犀草苷處理組(3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)。取對(duì)數(shù)期HUVECs，用胰酶消化后并吹打均勻以3×104每孔接種于96孔板中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜;用含10%牛血的1640培養(yǎng)液稀釋木犀草苷原液配成濃度3.25、6.25、12.5、25、50、100 mg/L工作液;將不同濃度的木犀草苷工作液加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄掉上清液，每孔加入20 μl CCK-8放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)。

2.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以3×103/ml接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、過(guò)氧化氫損傷組(100、200、400、800 μmol/L)。每組設(shè)6個(gè)副孔?？瞻讓?duì)照組每孔加入200μl無(wú)血清的1640培養(yǎng)液;過(guò)氧化氫各損傷組加入200μl無(wú)血清培養(yǎng)液配制的終濃度為100、200、400、800 μmol/L的H202;分別培養(yǎng)1 h、2 h、6 h、12 h、24 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入20 μl CCK-8(mg/mL)，置于孵箱中孵育30 min，于酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值，計(jì)算過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的抑制率。通過(guò)對(duì)細(xì)胞抑制率的計(jì)算從而確定過(guò)氧化氫損傷模型的最適條件。

抑制率(%)=1-［各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)］×100%

2.3 木犀草苷預(yù)處理對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力值的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔3× 103個(gè)接種于96孔板，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組為空白組，模型組和給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)在給藥24 h之后，加入濃度為200 μmol/L的 H2O2培養(yǎng)1 h。去除培養(yǎng)板中上清液，每孔分別加入20 μl CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)其OD值。

2.4 測(cè)定HUVECs中的SOD活性GSH-Px的活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為每孔3×103個(gè)接入96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組，模型組，給藥組(6.25、12.5、25 mg/L)每組設(shè)6個(gè)副孔，給藥24 h后，按H2O2損傷濃度為200 μmol/L損傷2 h，按照SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)SOD的活力和MDA的分泌水平。

2.5 測(cè)定臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中MDA和上清液中LDH的釋放量

同“2.4”項(xiàng)處理相同后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求操作，最后利用酶標(biāo)儀分別對(duì)細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px和上清液中的LDH進(jìn)行測(cè)定。

2.6 Hoechst33328染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，提前將蓋玻片放在70%乙醇中提前浸泡一段時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)上吹干后用PBS反復(fù)清洗3次。將處理過(guò)的蓋玻片放入6孔板內(nèi)，每孔可平行放入3個(gè)蓋玻片，接入密度為5×105個(gè)/mL的內(nèi)皮細(xì)胞，酒精消毒后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。吸出培養(yǎng)液加入含有木犀草苷(6.25、12.5、25 mg/L)的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至80%左右時(shí)，采用含有過(guò)氧化氫的1640培養(yǎng)基刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡。用移液槍吸盡培養(yǎng)液，每塊蓋玻片上滴入一滴固定液固定15 min。吸除固定液，用 PBS反復(fù)清洗3遍，每次2 min(洗滌時(shí)用手動(dòng)搖晃數(shù)次)。加入0.5 mL Hoeehst33258染色液染色，避光染色10 min(染色時(shí)也應(yīng)手動(dòng)搖晃數(shù)次)染色后吸除染色液，用PBS清洗3次，每次2 min。在載玻片上滴一滴封片液熒光淬滅，將含有染好顏色細(xì)胞的蓋玻片蓋在載玻片上。(盡量避免氣泡生成)調(diào)整熒光顯微鏡，采用CCD數(shù)碼相機(jī)照相，采用圖像分析處理軟件NIS-Element:BR3.0處理。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度木犀草苷對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1，與正常組比較，3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L作用細(xì)胞24 h，其中6.25、12.5、25 mg/L作用后的細(xì)胞活力值明顯上升，3.25 mg/mL作用細(xì)胞后未見(jiàn)明顯提高，50、100、200 mg/L作用細(xì)胞后呈現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的趨勢(shì)，當(dāng)給藥濃度為400 mg/L時(shí)，與空白組比，細(xì)胞活力值明顯降低，表明高濃度木犀草苷抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作及臨床應(yīng)用藥物適用范圍，后續(xù)試驗(yàn)選用藥物濃度為6.25、12.5、25 mg/L。

表1 不同濃度Luteoloside對(duì)HUVECs活力值的影響(±s)

表1 不同濃度Luteoloside對(duì)HUVECs活力值的影響(±s)

C(μg/mL) Time(h) OD Proliferation(%) 0 24 1.126±0.003 100 3.125 24 1.114±0.015 101.33 6.25 24 1.159±0.001 102.93 12.5 24 1.163±0.055 103.29 25 24 1.180±0.052 104.80 50 24 1.118±0.052 99.29 100 24 1.061±0.058 94.23 200 24 1.052±0.036 93.43 400 24 0.858±0.036 76.20

3.2 HUVECs氧化損傷模型的建立

CK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著過(guò)氧化氫濃度的升高，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)抑制率逐漸升高(表2)。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度為200 μmol/L，作用時(shí)間2 h時(shí)，細(xì)胞抑制率為51.29%，過(guò)氧化氫濃度為400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率為 72.13%。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到 800μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率可達(dá)到92.77%。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率明顯增高，當(dāng)作用時(shí)間為12 h時(shí)，過(guò)氧化氫損傷濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率為 94.58%、濃度為 400 μmol/L時(shí)，抑制率為96.59%、濃度為800 μmol/L時(shí)，抑制率為98.17%，即細(xì)胞趨于全部死亡。因此過(guò)氧化氫濃度為200 μmol/L，作用2 h時(shí)，抑制率為50%作用為理想造模條件。

表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6，±s)

表2 Influence of H2O2on HUVECs(n=6，±s)

濃度(μmol/L)1 h 2 h 6 h 12 h 24 h 100 25.15 37.73 45.54 52.83 66.02 200 40.15 51.29 78.99 94.58 95.52 400 60.15 72.13 95.65 96.59 98.29 800 85.70 92.77 95.71 98.17 99.52

3.3 木犀草苷預(yù)處理對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力值的影響

結(jié)果見(jiàn)表3，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:Luteoloside預(yù)處理組細(xì)胞活力值均高于過(guò)氧化氫模型組(P＜0.05)，其中Luteoloside(6.25、12.5、25 μg/mL)三個(gè)濃度組對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs增殖作用顯著(P＜0.01)，并隨著給藥濃度的增大，對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力值下降具有明顯的上調(diào)作用。木犀草苷高劑量組(50、100 μg/mL)細(xì)胞活力值也高于模型組，但其差異微弱，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在預(yù)處理12～72 h不同條件下，給藥組對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力值下降都具有上調(diào)趨勢(shì)，其作用顯著(P＜0.01)，但不同時(shí)間的條件沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中選擇藥物作用時(shí)間為24 h。

表3 不同濃度的Luteoloside對(duì)氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

表3 不同濃度的Luteoloside對(duì)氧化損傷的HUVECs增值的作用(±s)

注:與H2O2組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與Control比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 OD Inhibitory rate(%) Control 2.188±0.063 0 H2O2組 1.370±0.024△△46.21 Luteoloside(3.125 ug/mL)+H2O 1.499±0.008＊＊39.20 Luteoloside(6.25 ug/mL)+H2O21.581±0.009＊＊34.33 Luteoloside(12.5 ug/mL)+H2O21.599±0.038＊＊33.31 Luteoloside(25 ug/mL)+H2O21.679±0.039＊＊28.79 Luteoloside(50 ug/mL)+H2O21.496±0.012＊＊39.14 Luteoloside(100 ug/mL)+H2O21.452±0.021*41.63

3.4 木犀草苷對(duì)HUVECs中的SOD活性及GSH-Px活性的影響

結(jié)果見(jiàn)圖1～2。木犀草苷各藥物濃度組和空白組的SOD、GSH-Px活性明顯高于過(guò)氧化氫損傷組(P＜0.01);隨著藥物濃度的增加，SOD活性有逐漸升高的趨勢(shì)，藥物組之間兩兩比較，木犀草苷低濃度組與中濃度組比較，中濃度組與高濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，低濃度組與高濃度組比較差異顯著(P＜0.01)。

圖1 Luteoloside對(duì)氧化損傷HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性的影響(±s)

圖2 Luteoloside對(duì)氧化損傷HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的影響(±s)

3.5 木犀草苷對(duì)受損HUVECs中MDA和LDH含量的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3～4。與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中MDA含量明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。與模型組比較，藥物組中MDA的含量明顯低于模型組(P＜0.01)，Luteoloside能明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的含量(P＜0.01)，并隨著給藥濃度的增高，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)合成的能力逐漸增強(qiáng)。給藥物組各個(gè)濃度組間比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 Luteoloside對(duì)氧化損傷HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的影響(±s)

圖4 Luteoloside對(duì)氧化損傷HUVEC細(xì)胞上清液中LDH含量的影響(±s)

3.6 各組熒光顯微鏡結(jié)果

結(jié)果如圖5所示:在熒光顯微鏡下觀察，空白組細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞與細(xì)胞之間排列緊湊，分布均勻，染色均勻且程度較淺，在視野中呈現(xiàn)淺藍(lán)色染核形態(tài)。與空白組比較，模型組細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核會(huì)呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白部分細(xì)胞呈亮藍(lán)色濃染并有熒光小體產(chǎn)生。與模型組相比，木犀草苷保護(hù)組熒光小體較少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較正常，排列比較緊湊，細(xì)胞核染色呈淺藍(lán)色染核形態(tài)，凋亡細(xì)胞伴隨的細(xì)胞質(zhì)染色即熒光小體隨著給藥濃度的增高，熒光小體逐漸減少，濃染細(xì)胞數(shù)量呈遞減趨勢(shì)，表明木犀草苷具有抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

圖5 各組熒光顯微鏡結(jié)果

4 討論

蓬子菜資源豐富，民間藥用廣泛且藥用史長(zhǎng)，其主要的化學(xué)成分為黃酮類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、具有保護(hù)心腦血管、抗炎、抗血栓、止血、消腫、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性［6-10］。木犀草苷(luteoloside)即木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)，為黃酮類化合物，是一種廣譜、有效的抗氧化劑，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，可與氧自由基反應(yīng)生成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移方式清除體內(nèi)的自由基，提高抗氧化酶的活性，還原氧化物質(zhì)，發(fā)揮其抗氧化的作用。本次試驗(yàn)對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)及乳酸脫氫酶(LDH)的含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，過(guò)氧化氫損傷模型組中SOD及GSH-Px活性顯著降低(P＜0.01)，而 MDA及上清液中的 LDH顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，木犀草苷預(yù)處理各組SOD及GSH-Px活性明顯增高，而MDA和LDH含量顯著降低(P＜0.01)。表明木犀草苷具有提高HUVEC細(xì)胞抗氧化能力，減輕由自由基攻擊細(xì)胞膜引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減輕過(guò)氧化氫損傷HUVEC細(xì)胞程度。綜上所述木犀草苷可能具有升高氧化損傷的HUVECs中SOD、GSH-Px活性及降低MDA和LDH含量，對(duì)由過(guò)氧化氫造成的HUVECs氧化損傷具有保護(hù)作用。

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R28

A

1002-2406(2017)02-0005-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.201281274034);教學(xué)部博士點(diǎn)博導(dǎo)類基金資助項(xiàng)目(No.20112327110006)

孫超(1989-)，男，碩士研究生，主要研究方向:中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

馬英麗*(1954-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。

2016-05-20

修回日期:2016-06-01