姜衛(wèi)星，王海燕，索成云，張海峰，孫永新，吳麗宏，張艷慶

(1.冀中能源峰峰集團總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200;2.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注大鼠氧化應激損傷的保護作用

姜衛(wèi)星1，王海燕2，索成云1，張海峰1，孫永新1，吳麗宏1，張艷慶1

(1.冀中能源峰峰集團總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200;2.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的:研究生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注大鼠氧化應激損傷的保護作用。方法:將120只SD大鼠隨機分為6組:假手術組、模型組、生姜醇提取物(100、200、400 mg/kg)組和金納多;術前2周開始灌胃給藥，每天1次;采用夾閉肝門靜脈和肝動脈1 h后松夾的方法制備肝臟缺血再灌注大鼠模型。再灌注2 h后，測定肝臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;測定血清中總抗氧化能力(T-AOC)水平和轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)、乳酸脫氫酶(LDH)含量;HE染色法觀察肝臟組織形態(tài)結(jié)構改變;TUNEL法觀察肝細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI);Western blotting法檢測肝組織中NF-κB表達并進行半定量分析。結(jié)果:生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組大鼠肝臟組織中SOD和CAT活性較模型組顯著升高，而MDA含量和血清中ALT、AST、LDH水平顯著降低，其中400 mg/kg組GSH-Px活性和T-AOC水平均顯著升高;生姜醇提取物各組大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構改變和肝細胞凋亡狀況較模型組均明顯改善，均以400 mg/kg組效果最為顯著;生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組肝細胞AI較模型組顯著降低、NF-κB蛋白表達顯著下調(diào);上述差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論:生姜醇提取物能夠有效改善肝臟組織中抗氧化酶活性、抑制肝臟組織病變、改善肝功能、抑制肝細胞凋亡，提示生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注大鼠氧化應激損傷具有保護作用。

生姜醇提取物;肝臟;缺血再灌注;氧化應激

肝臟組織是血流量非常大的器官之一，因此肝臟手術過程中經(jīng)常需要暫時阻斷肝臟血流以減少出血，但恢復血流再通后所產(chǎn)生的再灌注損傷，將進一步損傷肝細胞，影響肝功能［1］。隨著病理生理機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)再灌注過程中所產(chǎn)生的大量氧自由基是造成再灌注損傷的重要因素［2］。生姜為姜科植物姜的新鮮根莖，性味辛溫，具有解表散寒、溫中止嘔、行水解毒之功效，為我國臨床廣泛應用的傳統(tǒng)中藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，生姜具有良好的抗氧化活性［3］。本實驗通過夾閉肝門靜脈和肝動脈1 h后松夾的方法制備肝臟缺血再灌注大鼠模型，研究生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注后氧化應激損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與試劑

生姜醇提取物(陜西旭煌植物科技有限公司，批號140728，以姜辣素計:純度≥90%);金納多(臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司，批號20141209);SOD、GSH-Px、CAT、MDA、T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為 150416、150523、150129、141217、150419);ALT、AST、LDH試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號分別為150124002，150312011，150309007);HE染色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司，批號150316、150124);NF-κB單克隆抗體(批號150327，北京博奧森生物技術有限公司);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(批號150506，南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物

清潔級級SD大鼠(雄性，7周齡，體質(zhì)量220～260 g)，購自河北省實驗動物中心，許可證號:SCXK (冀)2013-1-003。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型制備

120只SD大鼠隨機分為6組:假手術組、模型組、生姜醇提取物(100、200、400 mg/kg)組和金納多(4 mg/kg)組;術前2周開始灌胃給藥，每天1次，假手術組和模型對照組同步給予等體積生理鹽水。除假手術組外，其余各組大鼠均參照Taniguchi等［4］研究報道的方法制備大鼠肝臟缺血再灌注模型:使用無創(chuàng)動脈夾夾閉肝門靜脈和肝動脈，1 h后恢復血流再灌注;假手術組行手術通路，但不阻斷肝門靜脈和肝動脈，其余操作同手術組;再灌注2 h后經(jīng)腹主動脈取血，并取肝臟標本，保存待測。

1.3.2 肝臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量的檢測

取肝臟組織標本，剪碎后行研磨勻漿，3 000 rpm離心10 min后取上清液，嚴格按照試劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠肝臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和MDA含量。

1.3.3 血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量檢測

取血液標本，經(jīng)1 500 rpm離心10 min后取血清，按照各劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計測定血清中T-AOC水平并通過全自動生化檢測儀測定ALT、AST和LDH含量。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)結(jié)構改變、肝細胞凋亡狀況的觀察及AI的計算

取肝臟組織標本，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(厚度約5 μm)后，參照試劑盒步驟行HE染色，于倒置光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)學改變。取石蠟切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化、PBS浸洗、4%多聚甲醛固定15 min、PBS洗劑、去離子水沖洗、滴加100 μl TUNEL反應混合液于標本上(37℃暗濕盒中反應1 h)、終止反應、PBS 5min×3次、DAB避光顯色后，通過光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況(細胞核黃染為陽性著色)。AI計算:每張染色切片隨機選取6個視野，分別計數(shù)每個視野中細胞總數(shù)和陽性著色細胞數(shù)，各組分別取平均值，然后計算AI。

AI(%)=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

1.3.5 肝組織中NF-κB表達的檢測及半定量分析

取1.3.2制備的肝組織勻漿上清液，BCA法測定蛋白含量后進行后續(xù)反應，進行蛋白變性(90℃水浴10 min)、上樣、10%SDS-PAGE恒壓電泳(4℃，電壓80 V，30 min)+分離膠(4℃，電壓120 V，120 min)、轉(zhuǎn)NC膜(轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30 min)、印跡電轉(zhuǎn)移(4℃，100 V，3.5 h)、春紅溶液染色、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4℃過夜、PBS溶液洗膜，二抗室溫孵育1 h后，經(jīng)ECL顯色，實驗結(jié)果應用Quantity One軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

運用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用χ2檢驗;P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量比較

模型組大鼠肝臟組織中抗氧化酶(SOD、GSHPx、CAT)活性較假手術組顯著降低且MDA含量顯著升高(P＜0.01);生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組和金納多組SOD、CAT活性較模型對照組均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，MDA含量顯著降低(P＜0.01)，并且400 mg/kg預處理組 GSH-Px活性顯著升高(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較(±s)

表1 各組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較(±s)

注:與假手術組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 n SOD(U/mg prot) GSH-Px(U/mg prot) CAT(U/mg prot) MDA(nmol/mg prot)假手術組10 13.2±2.8 18.9±3.5 4.0±0.7 3.4±0.8模型組 10 6.4±2.0△△9.7±2.4△△2.3±0.5△△9.3±2.2△△生姜醇提取物100 mg/kg組 10 7.0±2.3 10.5±2.7 2.8±0.7 8.2±2.5生姜醇提取物200 mg/kg組 10 8.5±2.7*11.4±3.3 3.1±0.8*5.7±1.9＊＊生姜醇提取物400 mg/kg組 10 10.3±3.1＊＊13.1±3.7＊＊3.5±0.7＊＊4.8±1.6＊＊金納多4 mg/kg組 10 9.1±2.9*11.2±3.1 3.0±0.6*6.1±1.8*

2.2 各組大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比較

模型組大鼠血清中T-AOC水平較假手術組顯著降低(P＜0.01)，ALT、AST、LDH含量顯著升高(P＜ 0.01);生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組和金納多組ALT、AST、LDH含量較模型組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中400 mg/kg組 T-AOC水平顯著升高(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比較(±s)

表2 各組大鼠血清中T-AOC水平和ALT、AST、LDH含量比較(±s)

注:與假手術組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 n T-AOC(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) LDH(U/L)假手術組10 11.8±1.3 109.3±12.4 51.6±4.2 572.4±76.3模型組 10 6.2±0.9△△1270.4±142.5△△947.2±125.3△△1193.5±142.1△△生姜醇提取物100 mg/kg組 10 7.1±1.1 814.3±153.7*803.5±120.9 967.0±122.9生姜醇提取物200 mg/kg組 10 7.9±1.4 596.2±92.6＊＊562.8±109.6*822.9±98.7*生姜醇提取物400 mg/kg組 10 8.6±1.7*417.5±80.1＊＊397.4±121.3＊＊754.8±81.6＊＊金納多4 mg/kg組 10 7.5±1.5 604.9±128.0＊＊580.3±103.5*816.5±102.2*

2.3 各組大鼠肝臟組織細胞病理性形態(tài)學改變

假手術組大鼠肝臟組織結(jié)構及肝細胞形態(tài)均未見異常;模型組大鼠肝臟組織結(jié)構呈現(xiàn)肝組織紋理不清、肝竇充血、部分肝小葉結(jié)構模糊，肝細胞呈空泡變性和壞死、胞核固縮并深染等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構改變;生姜醇提取物各組和金納多組肝臟組織病理性形態(tài)結(jié)構改變呈不同程度改善，以生姜醇提取物400 mg/kg組效果最為顯著，見圖1。

2.4 各組大鼠肝細胞凋亡狀況及AI

經(jīng)TUNEL染色后觀察發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠肝臟組織僅存在極少量凋亡細胞，模型組凋亡細胞數(shù)量較假手術組明顯增多;與模型組比較，生姜醇提取物各組細胞凋亡狀況明顯好轉(zhuǎn)，以400 mg/kg組效果最為顯著，見圖2。計算AI發(fā)現(xiàn):模型組大鼠肝臟細胞AI較假手術組顯著升高(P＜0.01)，而生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組和金納多組AI較模型對照組均顯著降低(P＜0.01)，結(jié)果見表3。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理性形態(tài)學改變(HE，×400)

圖2 各大鼠肝臟細胞凋亡狀況比較(TUNEL，×400)

2.5 各組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達

通過Western blotting檢測并進行半定量分析發(fā)現(xiàn):模型對照組大鼠肝組織中NF-κB蛋白表達較假手術組顯著上調(diào)(P＜0.01);而生姜醇提取物(200、400 mg/kg)組和金納多組NF-κB蛋白表達較模型組顯著下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果見圖3和表3。

圖3 各組大鼠肝組織NF-κB蛋白表達量的變化

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡指數(shù)及NF-κB蛋白表達量(±s)

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡指數(shù)及NF-κB蛋白表達量(±s)

注:與假手術組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 n AI(%) NF-κB/β-actin假手術組10 2.3±1.5 0.15±0.04模型組 10 38.5±7.2△△0.42±0.13△△生姜醇提取物100 mg/kg組 10 29.1±6.6 0.37±0.12生姜醇提取物200 mg/kg組 10 23.4±5.0＊＊0.32±0.09*生姜醇提取物400 mg/kg組 10 14.2±3.7＊＊0.26±0.08＊＊金納多4 mg/kg組 10 25.1±5.4＊＊0.30±0.10*

3 討論

肝臟是對氧非常敏感的器官，低血容量性休克以及肝臟手術過程中暫時阻斷肝臟血流，均會導致急性缺血再灌注損傷。隨著病理生理機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)隨著氧的涌入，氧自由基的大量生成和過剩，進而誘發(fā)的氧化應激損傷是導致肝臟缺血再灌注損傷非常重要的病理機制之一［5］。張琳［6］和李偉等［7］通過藥物干預肝臟缺血再灌注損傷大鼠模型發(fā)現(xiàn)，抑制氧化應激損傷能夠有效降低肝臟缺血再灌注損傷。

氧自由基過剩是導致機體氧化應激損傷的病理基礎，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基能夠在SOD催化作用下還原生成過氧化氫［8］并在GSH-Px或CAT的催化作用下進一步還原生成對人體無害的水和氧［9-10］，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能夠反映機體抗氧化能力;T-AOC水平能夠反映機體抗氧化能力;而MDA為機體脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量水平能夠間接反映機體氧化應激損傷程度。ALT、LDH主要存在于肝細胞胞漿中而AST主要存在于肝細胞線粒體中，它們在血清中的含量是反映肝功能最重要、最敏感的指標;正常生理狀態(tài)下它們的含量都非常低，而當細胞膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊而受損后將迅速釋放入血，導致血清中含量陡然增高，所以血清中ALT、AST和LDH含量水平能夠非常敏感的反應肝臟組織受損傷程度。

細胞凋亡是一種繼發(fā)性行為，而氧化應激損傷是其非常重要的誘發(fā)因素［11-13］，因此細胞凋亡狀況也能間接反映機體氧化應激損傷程度。NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，常態(tài)下NF-κB以無活性形式存在于胞質(zhì)中，而當細胞受到外界因素刺激時，NF-κB將被激活并參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達。張楷等［14］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB激活在氧化應激誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮著關鍵作用。

生姜為姜科植物姜的新鮮根莖，為我國傳統(tǒng)中藥之一，其提取物具有良好的抗氧化活性。本研究采用夾閉肝門靜脈和肝動脈1 h后松夾的方法制備肝臟缺血再灌注大鼠模型，研究生姜醇提取物對肝缺血再灌注大鼠氧化應激損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)生姜醇提取物能夠有效改善肝臟組織抗氧化酶活性、減輕脂質(zhì)過氧化損傷、抑制肝臟組織病變、改善肝功能，提示生姜醇提取物對肝臟缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷具有保護作用。

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Protective Effect of Ethanol extract of Zingiber Officinale on Oxidative Stress after Hepatic Ischemia-reperfusion in Rats

JIANG Wei-xing1，WANG Hai-yan2，SUO Cheng-yun1，ZHANG Hai-feng1，SUN Yong-xin1，WU Li-hong1，ZHANG Yan-qing1
(1.General Hospital of Fengfeng Group，Handan 056200，China;2.Handan Central Hospital，Handan 056001，China)

Objective:To investigate the protective effect of ethanol extract of zingiber officinale on oxidative stress after hepatic ischemia-reperfusion in rats.Methods:120 rats were randomly devided into six groups: sham operation group，model group，ethanol extract of zingiber officinale 100，200，400 mg/kg groups and Ginaton 4mg/kg group.Two weeks before operation，the drugs were given by intragastric administration，once a day.Two hours after reperfusion，the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in hepar were determined;the level of T-AOC and the content of ALT，AST，LDH in serum were determined;the histopathological changes and hepatocyte apoptosis were observed，and the apoptosis index(AI)was calculated;the expression of NF-κB protein was detected by Western blotting and semi-quantitative analysis.Results:Compared with the model group，the activities of SOD，CAT in hepar of ethanol extract of zingiber officinale 200，400 mg/kg groups were significantly increased;the contents of MDA in hepar and the content ofALT，AST，LDH in serum were significantly decreased;the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in 400 mg/kg group were significantly increased;the histopathological changes and the hepatocyte apoptosis were significantly improved compared with those of model group;the AI of 200，400 mg/kg groups was significantly decreased(P＜0.01);the expression of NF-κB proten was significantly down-regulated.All of the above differences were significant(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:Ethanol extract of zingiber officinale can effectively improve the activity of antioxidase，inhibit the histopathological changes，improve hepar function，depress hepatocyte apoptosis，suggesting that ethanol extract of zingiber officinale has a protective effect on oxidative stress after focal hepatic ischemia-reperfusion in rats.

Ethanol extract of zingiber officinale;Hepar;Ischemia-reperfusion;Oxidative stress

R285.5

A

1002-2406(2017)02-0009-05

邯鄲市科學技術研究與發(fā)展計劃項目(No.1623208094ZC)

姜衛(wèi)星(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事外科疾病研究工作。

2016-07-19

修回日期:2016-08-10