韓文杰，王晴，張旗，丁楠，高菁，陳丹陽，李強

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

赤芍對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的預(yù)防作用

韓文杰，王晴，張旗，丁楠，高菁，陳丹陽，李強*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

目的:探討赤芍不同給藥劑量對大鼠脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的預(yù)防作用，篩選最佳給藥劑量，為后期藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。方法:SD大鼠隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥(DEX)組、模型組(LPS組)、空白組(NS組)，每組10只。采用氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素方法［1］建立急性肺損傷模型，造模12h后取肺灌洗液檢測白細(xì)胞數(shù)目、蛋白濃度，取右肺上葉測濕干比，取右肺下葉觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:地塞米松、赤芍高中劑量給藥組均能顯著減少白細(xì)胞數(shù)目(P＜0.05)，降低肺濕干比(W/D)(P＜0.05)和蛋白濃度(P＜0.05)，緩解肺水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞浸潤，改善肺內(nèi)出血情況。結(jié)論:赤芍能顯著改善肺部結(jié)構(gòu)受損、肺水腫、中性粒細(xì)胞浸潤等病變，尤其以中劑量為佳。

赤芍;急性肺損傷;內(nèi)毒素

急性肺損傷(ALI)是肺部的嚴(yán)重?zé)o序狀態(tài)，死亡率較高，每年都造成約0.175%的人死亡。ALI的標(biāo)志包括肺泡-毛細(xì)血管屏障的破壞，肺水腫外滲進(jìn)入血管間隙和肺泡內(nèi)白細(xì)胞浸潤。而當(dāng)氧合指數(shù)惡化到低于200的PaO2/FiO2濃度時將會引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］。ARDS的突出的臨床特征描述為嚴(yán)重的呼吸困難，呼吸急促，肺順應(yīng)性下降和彌漫胸部X光浸潤。組織病理學(xué)變化包括間質(zhì)和肺泡出血和水腫，肺泡中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞，但最突出的表現(xiàn)為透明膜的存在［2］。急性肺損傷還是多器官障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要組成部分，致死率極高。急性肺損傷的發(fā)病機理十分復(fù)雜，目前國內(nèi)外專家并沒有能力對其完全闡述。目前認(rèn)為，肺內(nèi)過度的失控性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致各種病因ALI的根本原因［3］。

赤芍為清熱涼血的代表藥物，含有多種化學(xué)成分，具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效。近年來，有關(guān)赤芍的研究不少［4-5］，但是對其作用的最佳給藥劑量及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究未見報道。本文從篩選最佳劑量入手，探討不同給藥劑量對ALI的干預(yù)作用，以期確定最佳給藥劑量，為后期藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究做好鋪墊，并最終開發(fā)出治療急性肺損傷的理想藥物，更好地應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性70只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號:11400700036742。

1.1.2 試劑及主要儀器

赤芍藥材購自河北安國藥材市場(批號20151123)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生鑒定系劉春生教授鑒定為毛茛科植物赤芍的干燥根;大腸桿菌內(nèi)毒素(L2880，sigma);牛血清白蛋白(A7030，PH -7，sigma);地塞米松注射液(批號1507111);吉姆薩染液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司);考馬斯亮藍(lán)G-250 (北京拜爾迪生物科技有限公司);TXD型離心甩片機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司);Effendorf5810R離心機(德國);血液分析儀、Bx40F4型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本);AxioCam ERC5s成像系統(tǒng)(德國蔡司數(shù)碼成像系統(tǒng))。

1.2 實驗方法

1.2.1 赤芍水提物制備

赤芍藥材，10倍量水，回流提取3次，每次1 h，四層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮得到赤芍水提物高中低3種劑量，含生藥量分別為1 ml≈1 g，1 ml≈0.5 g，1 ml≈0.17 g。

1.2.2 內(nèi)毒素性急性肺損傷(ALI)模型制備

將大鼠隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥(DEX)組、模型組(LPS組)、空白組(NS組)。動物正常飼養(yǎng)兩天后灌胃，分別灌胃三種赤芍水提物，每日1次，每次9 ml/kg，共計5天。造模前1 h，再灌胃1次，陽性藥組注射地塞米松注射液2 mg/kg。造模前，各組均用水合氯醛(4 mg/kg)麻醉，預(yù)防給藥組、陽性藥組、模型組氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素(LPS，5 mg/kg)，空白組在同樣條件下，氣管內(nèi)滴注等體積的生理鹽水。造模12 h后各組動物均取材。

1.3 指標(biāo)檢測

各組動物按照造模時間以腹主動脈取血處死后，剪開頸、胸部皮膚，分離氣管，行氣管插管。右支氣管結(jié)扎，用磷酸緩沖液(PBS)6 mL分3次進(jìn)行左肺灌洗(灌洗時保證每次打入、吸出等體積的液體)，收集肺泡灌洗液(BALF)4.5 ml，離心(4℃，1 300 r/min，10 min)。

1.3.1 BALF中蛋白含量測定

取離心后上清液，考馬斯亮藍(lán)法測定BALF中蛋白含量。以牛血清白蛋白(BSA)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，100 !g/ml考馬斯亮藍(lán)G-250染液加入待測稀釋液或蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(v∶v=5∶1)，渦旋儀振勻后20℃ ～25℃放置15 min，加入96孔板。充分反應(yīng)后，以考馬斯亮藍(lán)G-250染液作為調(diào)零孔，于酶標(biāo)儀595 mn處測吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算BALF中的蛋白含量。

1.3.2 肺濕干比(W/D)

收集灌洗液后，取右肺上葉，稱量濕重(W)，80℃烘干至恒重，稱取干重(D)，計算濕干比(W/D)。

1.3.3 BALF中白細(xì)胞計數(shù)

用500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重旋沉淀，吹打均勻。取400 μl于血液分析儀中檢測白細(xì)胞(WBC)數(shù)目。剩余100 μl混合液加入400 μl PBS，混勻。取100 μl于離心甩片機中離心做細(xì)胞涂片，吉姆薩(Gemsa)染色15 min，洗片，無水乙醇固定，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取右肺下葉，10%中性福爾馬林固定48 h，流水沖洗12 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(Hematoxylinand Eosin，HE)染色，封片，光鏡下病理觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD方法。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組白細(xì)胞(WBC)統(tǒng)計結(jié)果

LPS組BALF中WBC數(shù)目明顯高于NS組(P＜0.05)，顯示造模成功;與模型組相比，DEX組、高劑量組、中劑量組 WBC數(shù)目較 LPS組明顯降低(P＜0.05)，低劑量組WBC與LPS組比較并無明顯差異。結(jié)果說明LPS誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的聚集活化，低劑量給藥組并不能顯著降低炎性細(xì)胞數(shù)量，高劑量組及中劑量組均能減少炎性細(xì)胞數(shù)量，但兩者預(yù)防作用并無顯著差異，中劑量組相比高劑量組療效作用稍明顯。各組白細(xì)胞數(shù)目見表1。

表1 各組白細(xì)胞(WBC)數(shù)目(±s，n=6)

表1 各組白細(xì)胞(WBC)數(shù)目(±s，n=6)

注:與空白組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05。

組別 WBC(109個/L)高劑量組 50.15"10.91*中劑量組 42.87"6.93*低劑量組 65.87"6.10 DEX組 18.43"3.83*LPS組 71.80"10.60#NS組 5.94"0.65

2.2 各組Gimsa染色細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目觀察

空白組中細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見多形核白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，視野范圍內(nèi)可見細(xì)胞數(shù)目較少。模型組與空白組相比，細(xì)胞數(shù)目大量增多，多形核白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞大量浸潤，出現(xiàn)炎癥的明顯跡象，說明模型成功。三個給藥組與LPS組比較均能減少炎性細(xì)胞的數(shù)目，說明赤芍對于LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有一定預(yù)防作用，而且中劑量組預(yù)防作用強于其他兩劑量組。結(jié)果見圖1(×100)及圖2(×400)所示。

圖1 各組PMN圖涂片顯微鏡觀察(Gemsa染色，×100)

圖2 各組PMN圖涂片顯微鏡觀察(Gemsa染色，×400)

2.3 各組肺W/D ratio變化

肺W/D ratio用來評價肺水腫的嚴(yán)重程度。與正常組相比，模型組W/D ratio顯著升高(P＜0.05)，陽性藥組可顯著降低W/D ratio(P＜0.05)。三個給藥組W/D ratio均與模型組有顯著差異，中劑量組降低作用最明顯。結(jié)果說明LPS能引起肺泡通透性增加，造成肺損傷，而高、中、低三組預(yù)防給藥組均能減低肺水腫嚴(yán)重程度。結(jié)果見表2所示。

表2 不同給藥劑量各組W/D ratio(±s，n=6)

表2 不同給藥劑量各組W/D ratio(±s，n=6)

注:與空白組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05。

組別W/D ratio高劑量組 4.57"0.04*中劑量組 4.54"0.06*低劑量組 4.66"0.03*DEX組 4.31"0.11*LPS組 4.77"0.09#NS組 4.39"0.07

2.4 各組蛋白濃度變化

LPS組蛋白濃度相比空白組明顯升高(P＜0.05)，高劑量組、中劑量組蛋白濃度均比模型組顯著降低(P＜0.05)，且兩組作用并無顯著性差異。低劑量組蛋白濃度與模型組無明顯差異。模型組大鼠BALF中蛋白含量急劇增多，說明LPS刺激后大鼠肺泡通透性增加，炎性反應(yīng)加重，肺損傷較嚴(yán)重。而高、中預(yù)防給藥組均可以預(yù)防肺水腫，低劑量組對于LPS引起的炎性反應(yīng)無顯著改善作用。結(jié)果如表3顯示。

表3 不同給藥劑量各組蛋白濃度(±s，n=6)

表3 不同給藥劑量各組蛋白濃度(±s，n=6)

注:與空白組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05。

組別 蛋白濃度(μg/ml)高劑量組 200.81"16.59*中劑量組 196.60"10.96*低劑量組 228.97"9.41 DEX組 177.03"4.55*LPS組 240.50"13.73#NS組 101.40"17.72

2.5 肺組織病理形態(tài)學(xué)考察

NS組中肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄。大鼠肺組織中LPS組表現(xiàn)特征性病理改變的跡象，包括間質(zhì)性水腫，肺充血，肺泡壁和滲透增厚，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡塌陷和纖維化。LPS誘導(dǎo)的病理變化被高、中劑量組顯著減弱，低劑量組與模型組并無顯著差異。結(jié)果見圖3。

圖3 各組肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，×100)

3 討論

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞主要有多形核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等。活化的多形核白細(xì)胞會引發(fā)呼吸大爆發(fā)并釋放大量炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，損傷肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺水腫和肺換氣功能障礙。大量炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞構(gòu)成炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”，并通過NF-κB、p38絲裂霉素原活化蛋白激酶等信號通路調(diào)控機體炎癥反應(yīng)［6-8］。

根據(jù)ALI所引起的臨床表現(xiàn)，一般認(rèn)為多屬中醫(yī)的“暴喘”“結(jié)胸”“喘脫”等病證范圍［9］，葉天士《溫?zé)嵴摗分刑岢鲂l(wèi)氣營血辨證，《溫病條辨·上·十一》:“太陰溫病，血從上溢者，犀角地黃湯……”提出血從上溢，肺之化源速竭的溫病第一死癥，在病因病機和臨床表現(xiàn)上均符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué) ARDS的臨床特征［10］。SARS、流感等重大疫情，也屬中醫(yī)溫病學(xué)范疇。赤芍出現(xiàn)在很多經(jīng)方里，如《清瘟敗毒飲》《犀角地黃湯》等，專于涼血解毒化瘀。陳暢等［11］研究發(fā)現(xiàn)，赤芍能抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集，減少肺血管內(nèi)皮的傷害，抑制肺組織iNOS異常高表達(dá)，減少NO的生成和釋放，進(jìn)而減輕肺組織脂質(zhì)過氧化損傷。

以上結(jié)果顯示，赤芍高、中預(yù)防給藥組均能明顯減少白細(xì)胞數(shù)目、肺濕干比、蛋白濃度及降低肺組織病理程度，說明赤芍可以預(yù)防由LPS引起的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的炎性細(xì)胞浸潤、減輕肺水腫、減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，低劑量組不能顯著減輕以上癥狀。綜合以上指標(biāo)，中劑量為最佳給藥劑量，對預(yù)防急性肺損傷作用明顯。為進(jìn)一步研究赤芍作用于大鼠急性肺損傷的藥效物質(zhì)及作用機制奠定堅實的基礎(chǔ)，具有一定的參考價值。

［1］Mutz C，V Mirakaj，Vagts DA，et al.The neuronal guidance protein netrin-1 reduces alveolar inflammation in aporcine model of acute lung injury［J］.Critical care，2010，14(5):189.

［2］Costa EL，Amato MB.The new definition for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome:is there room for improvement?［J］.Current Opinion in Critical Care，2013，19(1):16-23.

［3］洪輝華，蔡宛如.急性肺損傷的發(fā)病機制及中醫(yī)藥治療的實驗研究進(jìn)展［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，31(1):33-135.

［4］李穎.不同劑量赤芍對馬錢子增效減毒作用影響的實驗研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2015，43(6):39-41.

［5］吳修紅，楊東霞，楊波，等.大孔樹脂純化赤芍中芍藥苷的工藝研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2012，40(1):74-75.

［6］劉家昌，孫燕妮，彭屹峰，等.益氣補腎活血方對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠JNK和P38MAPK的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2016，33(5):39-42.

［7］馬李杰，李王平，金發(fā)光.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機制的研究進(jìn)展［J］.中華肺部疾病雜志，2013，6(1):65-68.

［8］宋芊，相田園，許建梅，等.冬連膠囊對STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠P38mapk、CREB1及TGFβ1蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2016，33(1):1-5.

［9］耿耘，魏星.急性呼吸窘迫綜合征的中醫(yī)發(fā)病機理探討［J］.江西中醫(yī)藥，2002，33(5):11-12.

［10］汪東穎，楊愛東，郭永潔，等.急性肺損傷的中醫(yī)證治探討及思考［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(7):1010-1012.

［11］陳暢，夏中元，孟慶濤.赤芍對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷保護(hù)作用機制的研究［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2005，25(1):41-43.

Preventive Effect of Radix Paeoniae Rubra on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury in Rats

HAN Wen-jie，WANG Qing，ZHANG Qi，DING Nan，CAO Jing，CHEN Dan-yang，LI Qiang*
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective:To probe the preventive effect of different doses of Paeoniae Rubra Radix on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats，filtering the optimal dose and speculating the possible mechanism.Methods:SD rats were divided into a high dose group，a middle dose group，a low dose group，a positive drug group(DEX group)，a model group(LPS group)and a control group(NS group)，with 10 rats in each group.The model group was established by intratracheal administration of lipopolysaccharide.12 h later detect the number of white blood cells，protein concentration from the lung lavage fluid and measure wet weight and dry weight of upper lobe of the right lung and observe pathological changes of lower lobe of the right lung.Results:Dexamethasone，the high dose group and the middle dose group could significantly reduce the number of white blood cells(P＜0.05)，reduce lung wet to dry ratio(W/D)(P＜0.05)and protein concentration (P＜0.05)，relieve pulmonary edema，alveolar structural damage and inflammatory cell infiltration and reduce pulmonary hemorrhage.Conclusion:Radix paeoniae rubra can relieve the acute lung injury induced by lipopolysaccharide and the middle dose is the optimal.

Radix paeoniae rubra;Acute lung injury;Lipopolysaccharide

R285.5

A

1002-2406(2017)02-0014-04

韓文杰(1993-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2014級中藥學(xué)專業(yè)科碩研究生。

李強*(1972-)，男，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及功效成分組研究。

2016-06-21

修回日期:2016-07-01