宋藝君，郭濤，王昌利*，孫靜，張偉

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046;2.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安 710054)

質(zhì)量工藝

總評(píng)“歸一值”優(yōu)選陜產(chǎn)延胡索產(chǎn)地加工工藝

宋藝君1，郭濤2，王昌利1*，孫靜1，張偉1

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046;2.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安 710054)

目的:優(yōu)選陜產(chǎn)延胡索產(chǎn)地加工工藝。方法:對(duì)新鮮延胡索大小分檔，進(jìn)行蒸后切片、煮后切片、微波后切片、直接切片及傳統(tǒng)法等產(chǎn)地加工處理，測定不同處理方法對(duì)浸出物含量、有效成分含量的影響，并優(yōu)選最佳產(chǎn)地加工工藝。結(jié)果:微波后切片法總生物堿、延胡索乙素及原阿片堿含量均優(yōu)于煮后切片法、蒸后切片法、直接切片法和傳統(tǒng)加工法，而水溶性和醇溶性浸出物含量無明顯差異。結(jié)論:研究為陜產(chǎn)延胡索初加工技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，為其產(chǎn)地加工炮制一體化建立基礎(chǔ)。

延胡索乙素;原阿片堿;產(chǎn)地加工;延胡索;微波法

延胡索為罌粟科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖，產(chǎn)于浙江、陜西、安徽等地，近年來，陜西發(fā)展成為延胡索的主產(chǎn)區(qū)，已占到全國總產(chǎn)量的70%［1］。由于延胡索藥材自身的性質(zhì)，經(jīng)采挖后，易發(fā)霉變質(zhì)，因此藥材在炮制前應(yīng)先進(jìn)行產(chǎn)地加工。文獻(xiàn)多報(bào)道有關(guān)浙產(chǎn)延胡索的產(chǎn)地加工研究［2-5］，而陜產(chǎn)延胡索產(chǎn)地加工的系統(tǒng)研究筆者未見報(bào)道。且陜產(chǎn)延胡索產(chǎn)地加工無統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致加工后飲片質(zhì)量差異較大。因而本實(shí)驗(yàn)通過浸出物、總生物堿、延胡索乙素和原阿片堿等不同考察指標(biāo)，比較了煮后切片法和直接切片法、傳統(tǒng)法、蒸后切片法及微波后切片法等產(chǎn)地加工方法的差異，優(yōu)選出最佳的產(chǎn)地加工方法，為延胡索產(chǎn)地加工炮制一體化建立基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

U3000高效液相分析儀(賽默飛世爾科技公司);島津UV-2550紫外可見分光光度儀(島津公司); ST-803中藥材切片機(jī)(瑞安市賽特機(jī)電有限公司)。

延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)110726-201516)、原阿片堿對(duì)照品(批號(hào)110853-201404)均購于中國食品藥品檢定研究所;乙腈、甲醇為色譜純;其余試劑為分析純。

延胡索新鮮藥材采自陜西城固縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡本祥教授鑒定為罌粟科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的新鮮塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地加工方法延胡索飲片的制備

將延胡索鮮品除去須根、泥沙雜質(zhì)、洗凈后攤開瀝干水分，大小分檔，分別按表1加工方法加工處理。

表1 延胡索不同產(chǎn)地加工方法

2.2 浸出物測定

據(jù)2015版《中國藥典》四部2201(浸出物測定熱浸法)測定稀乙醇浸出物、水浸出物。

2.3 總生物堿含量測定［6］

2.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，用95%乙醇定容于50 mL容量瓶，得到48 μg/mL的延胡索對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備

精密稱取延胡索粉末約0.5 g，分別置于250 mL圓底燒瓶中，加水(100 mL，80 mL)加熱回流2次，每次保持微沸30 min。紗布過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮至50 mL，加氨水調(diào)至pH值10以上，移入250 mL分液漏斗中，用氯仿萃取2次每次50 mL，合并萃取液，加50 mL蒸餾水洗滌，棄去水層，合并氯仿液，回收氯仿至小體積，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用氯仿補(bǔ)充至刻度，備用。

2.3.3 最大吸收波長的確定

取上述所得樣品1 mL于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用95%乙醇溶解定容至10 mL容量瓶中，備用。以無水乙醇溶液作為空白溶液，分別把上述對(duì)照品溶液和稀釋后的樣品溶液在紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液在280 nm處有最大吸收，樣品溶液在273 nm處有最大吸收。最終選擇檢測波長280 nm，并在280 nm處測量樣品的吸光度。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于5 ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，從而得到濃度為9.6，19.2，28.8，38.4，48.0 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，以95%乙醇作為空白對(duì)照，在280 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)(C)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.019 9X+ 0.039 3，r=0.999 2，表明對(duì)照品濃度在9.6～48.0 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 樣品含量測定

取樣品粉末 0.5 g，各 3份，精密稱定，按照“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在280 nm測定吸收值，結(jié)果見表2。

2.4 延胡索乙素含量測定［7］

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Hypurity C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 um)，以甲醇 -0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào) pH值至6.0) (55∶45)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算不低于3000，與其他峰的分離度均大于1.5。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備

取經(jīng)105℃干燥至恒重的延胡索乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為123.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。

圖1 對(duì)照品及延胡索飲片測定延胡索乙素HPLC圖譜

2.4.3 供試品溶液制備

取樣品粉末(過3號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察

取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、20 μL，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=7.335 2X+0.454 4，r=0.999 9 (n=6)，結(jié)果表明，延胡索乙素在進(jìn)樣量0.247 2～ 2.472 0 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 樣品含量測定

取樣品粉末各3份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表2。

2.5 原阿片堿含量測定［8］

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Hypurity C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-三乙胺醋酸溶液(每1 000 mL水中加入冰醋酸30 mL，三乙胺8 mL)(18∶82)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為289 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見圖2。理論塔板數(shù)按原阿片堿峰計(jì)算不低于3 000，與其他峰的分離度均大于1.5。

圖2 對(duì)照品及延胡索飲片測定原阿片堿HPLC圖譜

2.5.2 對(duì)照品溶液制備

取經(jīng)105℃干燥至恒重的原阿片堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為219.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液制備

取樣品粉末(過3號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察

取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL，置10 ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至10 mL，同法再稀釋10倍，得到對(duì)照品溶液濃度為2.19 μg/mL，分別進(jìn)樣10、20、30、40、50 μL，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=230.39X+0.009 6，r=0.999 4(n=5)，結(jié)果表明，原阿片堿在進(jìn)樣量0.021 9～0.109 5 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5.5 樣品含量測定

取樣品粉末各3份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表2。

2.6 產(chǎn)地加工工藝選擇

用Hassan的方法對(duì)浸出物等5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理［7］，所有指標(biāo)均為取值越大越好，計(jì)算公式為di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，Ymin為指標(biāo)中最小值，Ymax為指標(biāo)中最大值?？傇u(píng)歸一值OD=(d1+d2+d3 +…dk)/k(k為指標(biāo)數(shù))，見表2。

不同初加工方法結(jié)果表明:微波法＞煮法＞直接切片法＞傳統(tǒng)法＞蒸法，且從有效成分含量來看，微波法明顯優(yōu)于其他方法，而浸出物含量無明顯差異，綜合考慮，最終選擇微波法作為延胡索的產(chǎn)地加工方法。

表2 延胡索產(chǎn)地加工工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3 討論

延胡索的產(chǎn)地加工方法有直接切片法、蒸后切片法、煮后切片法和傳統(tǒng)切片法，其中煮法和蒸法都是常用的產(chǎn)地加工方法。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道用微波后切片法對(duì)延胡索進(jìn)行產(chǎn)地加工［9］，本文經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，用微波法進(jìn)行產(chǎn)地初加工，可最大程度地減少總生物堿、延胡索乙素以及原阿片堿等主要成分的損失，可作為一種陜產(chǎn)延胡索產(chǎn)地加工方法推廣使用。

對(duì)于延胡索產(chǎn)地加工工藝的篩選，本試驗(yàn)對(duì)浸出物、總生物堿、延胡索乙素以及原阿片堿含量等多個(gè)指標(biāo)采用“歸一化”法評(píng)價(jià)，對(duì)各考察指標(biāo)進(jìn)行“歸一化”處理，以O(shè)D值為綜合指標(biāo)對(duì)延胡索產(chǎn)地加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)選其最佳的產(chǎn)地加工工藝。

本試驗(yàn)含量測定時(shí)，先嘗試用一種色譜條件同時(shí)測定延胡索乙素和原阿片堿，通過流動(dòng)相甲醇-水系統(tǒng)等度洗脫［7］和乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫［10］，結(jié)果原阿片堿色譜峰分離度較小，且延胡索乙素色譜峰對(duì)稱性差，均無法達(dá)到含量測定要求，因而分別用不同的色譜條件進(jìn)行了含量測定。

［1］周曉龍.延胡索產(chǎn)銷分析［J］.中國現(xiàn)代中藥，2013，15(4):340-341.

［2］張麗宏，游修琪，肖碧英，等.不同加工方法對(duì)延胡索質(zhì)量的影響［J］.中成藥，2011，33(3):471-476.

［3］徐建中，孫乙銘，俞旭平，等.鮮元胡一體化加工炮制技術(shù)研究［J］.中國中藥雜志，2011，36(18):2484-2487.

［4］徐建中，俞旭平，孫乙銘，等.元胡飲片初加工實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2011，34(7):1040-1043.

［5］王紅，田明，王一，等.高效液相色譜法測定延胡索總生物堿滴丸中巴馬汀堿和脫氫紫堇堿含量［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(1): 63-64.

［6］施婷婷，王建新，李希.延胡索總生物堿提取工藝的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥與臨床，2014，5(3):14-16.

［7］國家藥典委員會(huì).中華人共和國藥典［M］.一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:140-279.

［8］張林，李元波，張愛軍.總評(píng)“歸一值”優(yōu)選銀馬口服液的澄清工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22(2):26-28.

［9］容穗華，高妮.正交試驗(yàn)優(yōu)選延胡索微波炮制工藝［J］.中國藥房，2011，22(19):1769-1770.

［10］游修琪，顧雪竹，毛淑杰，等.延胡索產(chǎn)地不同加工品HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31(10):1481-1484.

R28

A

1002-2406(2017)02-0027-04

陜西中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目(No.2015PY12);陜西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.14JS023)

宋藝君(1982-)，女，講師，博士，主要研究方向:中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和炮制技術(shù)研究。

王昌利*(1958-)，男，教授，主要研究方向:中藥新藥。

2016-07-19

修回日期:2016-08-10