耿清偉 宋秀祖

杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009

表皮內(nèi)黑素細(xì)胞（melanocyte，MC）與鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）組成表皮黑素單元。皮膚顏色取決于MC合成黑素的能力、黑素轉(zhuǎn)運(yùn)到KC的效率及黑素在KC內(nèi)降解的速率［1?2］。近年來(lái)黑素轉(zhuǎn)運(yùn)及降解在影響皮膚顏色中的作用越來(lái)越受到重視。既往研究認(rèn)為，黑素小體（melanosome）是黑素轉(zhuǎn)運(yùn)與降解的主要載體，新近研究發(fā)現(xiàn)的黑素核（melanin core 或melanocore）胞吐-胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及轉(zhuǎn)運(yùn)后在KC內(nèi)的降解過(guò)程為黑素研究帶來(lái)新視角。

一、黑素核與黑素轉(zhuǎn)運(yùn)

1.黑素核與胞吐-胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：既往研究［3］認(rèn)為，黑素轉(zhuǎn)運(yùn)存在胞吐-胞吞、脫落-吞噬、細(xì)胞吞噬、膜融合途徑，這4 種途徑可能同時(shí)存在于黑素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，但不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在表皮擁有不同生理功能。研究顯示［1?2］，胞吐-胞吞途徑在黑素轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表皮基底層的MC合成黑素，黑素與淀粉樣基質(zhì)聚合形成黑素核，之后形成具有膜結(jié)構(gòu)的黑素小體，隨著MC樹突不斷延長(zhǎng)，黑素從樹突中泌出，被KC 吞噬，形成胞吐-胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)入KC內(nèi)的黑素周圍具有不同膜結(jié)構(gòu)，在胞吐-胞吞途徑中，既往認(rèn)為具有膜結(jié)構(gòu)的黑素小體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)，而新近研究證實(shí)，無(wú)膜包裹的黑素核是黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的主要形式。Tarafder等［4］通過(guò)透射電鏡觀察正常人表皮發(fā)現(xiàn)，KC 和MC 外間隙是無(wú)膜包裹的黑素核，而轉(zhuǎn)運(yùn)到KC內(nèi)的黑素核則大部分被單層膜包裹，進(jìn)一步通過(guò)共聚焦顯微鏡與冷凍免疫電鏡發(fā)現(xiàn)，KC內(nèi)的黑素核上無(wú)酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）表達(dá)，TYRP1是黑素小體膜的標(biāo)記蛋白，證實(shí)KC內(nèi)包裹黑素核的單層膜來(lái)自KC。之后的多項(xiàng)研究［5?7］也觀察到了KC 和MC細(xì)胞間隙中存在無(wú)膜包裹的黑素核。Correia等［8］研究發(fā)現(xiàn)相比墨魚分泌的黑素、合成的黑素、人黑素瘤細(xì)胞系MNT?1細(xì)胞分離出的黑素體，使用Vivaspin超濾離心管離心MNT?1細(xì)胞培養(yǎng)基所提取的黑素核與KC 共培養(yǎng)后可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至KC 內(nèi)，并在核周形成“黑素帽”結(jié)構(gòu)，這提示只有有效分離出的黑素核才可有效轉(zhuǎn)運(yùn)。黑素核在保護(hù)皮膚抵御紫外線的損傷中具有重要作用。Yi 等［5］發(fā)現(xiàn)，受損的黑素核不能保護(hù)表皮KC細(xì)胞核抵御紫外線的損傷，表明具有完整結(jié)構(gòu)的黑素核是維持保護(hù)功能的關(guān)鍵。

2.胞吐過(guò)程影響因素：包括Rab11b和KC的作用。

（1）Rab11b：Rab 蛋白在調(diào)節(jié)囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定、融合方面具有“分子開關(guān)”作用。研究顯示［9］，Rab11a 和Rab11b 的缺失可致MC 內(nèi)黑素集聚。Tarafder 等［4］發(fā)現(xiàn)，Rab11b 的缺失可導(dǎo)致KC 誘導(dǎo)的黑素胞吐顯著減少，而Rab27a缺失則對(duì)黑素胞吐無(wú)明顯影響；而通過(guò)共聚焦顯微鏡可見Rab11b聚集于MC核周圍，與黑素小體非常相近，但很少與黑素小體膜標(biāo)記TYRP1 以及未成熟黑素小體標(biāo)記PMEL17共定位，這說(shuō)明MC內(nèi)的Rab11b定位在與黑素小體鄰近的囊泡中，并不在未成熟的黑素小體上。

（2）KC 的作用：研究發(fā)現(xiàn)［4，10］，MC 和KC 共培養(yǎng)可誘導(dǎo)MC分泌更多的黑素，KC可分泌多種細(xì)胞因子如ɑ促黑素細(xì)胞生長(zhǎng)激素（ɑ?MSH）、前列腺素E2（PGE2）等影響MC 的生物學(xué)性狀。張園園等［11］發(fā)現(xiàn)，MC與KC共培養(yǎng)后MC表面坑狀結(jié)構(gòu)增多，認(rèn)為這些坑狀結(jié)構(gòu)與MC胞吐黑素小體有關(guān)，可能是胞吐后留下的印跡，分別予ɑ?MSH、PGE2與KC共培養(yǎng)均可以促進(jìn)MC表面坑狀結(jié)構(gòu)增多，胞吐增強(qiáng)。

3. 胞吞過(guò)程影響因素：包括蛋白激酶受體2（PAR2）、Rab5和紫外線。

（1）PAR2：KC 表面的PAR2 參與調(diào)控?cái)z取黑素的胞吞過(guò)程［12］。Correia等［8］從MNT?1細(xì)胞組織勻漿中提取出有膜結(jié)構(gòu)的黑素小體和從培養(yǎng)基中分離出分泌的無(wú)膜的黑素核，分別添加到培養(yǎng)的小鼠KC 中發(fā)現(xiàn)，黑素小體和黑素核都可被KC 吞入胞內(nèi)，但只有黑素核的攝取依賴PAR2信號(hào)通道，且只有被吞噬的黑素核可在KC核周形成“黑素帽”結(jié)構(gòu)。這提示無(wú)膜的黑素核的攝取和分布受信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控。

（2）Rab5：在膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中具有重要作用，是內(nèi)涵體融合和胞吞的限制性蛋白［13］。Correia 等［8］發(fā)現(xiàn)，KC 對(duì)黑素核的攝取依賴早期內(nèi)涵體效應(yīng)子Rab5，而晚期內(nèi)涵體Rab7和Rab9對(duì)黑素核的攝取無(wú)影響。

（3）紫外線：紫外線照射可促進(jìn)黑素核向KC 轉(zhuǎn)運(yùn)。Yi等［5］將MNT?1細(xì)胞中提取的黑素核與KC共培養(yǎng)，使用UVB照射后KC 內(nèi)的黑素核明顯增加，這些黑素核可在KC 核周形成“黑素帽”結(jié)構(gòu)。紫外線照射可誘導(dǎo)PAR2高表達(dá)，并促進(jìn)PAR2在KC膜上的移位和激活，增強(qiáng)KC對(duì)黑素小體的吞噬，從而促進(jìn)和加速黑素轉(zhuǎn)運(yùn)；而且PAR2表達(dá)及對(duì)紫外線的敏感性與皮膚類型相關(guān)，膚色越深PAR2表達(dá)越強(qiáng)，對(duì)紫外線的誘導(dǎo)效應(yīng)越強(qiáng)［14］。

二、黑素核轉(zhuǎn)運(yùn)后的降解

黑素核轉(zhuǎn)運(yùn)到KC 后被溶酶體膜包被再次形成黑素小體。不同膚色KC內(nèi)具有不同大小、形態(tài)的黑素小體。先前研究認(rèn)為，淺色皮膚中黑素小體較小，2 ～10個(gè)成簇聚集于溶酶體中，在棘層中部降解；而深色皮膚中黑素小體較大，孤立分布于溶酶體中，降解速率相對(duì)淺色皮膚慢［15］。Hurbain 等［7］發(fā)現(xiàn)，多種膚色中孤立和成簇的黑素核可同時(shí)存在，深色皮膚中成簇黑素核比例明顯減少；通過(guò)電子斷層分析不同膚色KC中黑素核的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，所有皮膚類型中孤立和成簇分布的黑素核都被單層外膜包裹并嵌入一個(gè)不均勻的、電子致密的未知成分基質(zhì)中，淺色皮膚中基質(zhì)的邊緣密度較小且模糊，提示黑素存在一定的降解。Minwalla等［16］通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)，將淺色皮膚KC 與深色皮膚MC 共培養(yǎng)后，黑素成簇分布；而將深色皮膚KC與淺色皮膚MC共培養(yǎng)后，黑素孤立存在，提示KC 內(nèi)的特異性調(diào)節(jié)因子決定了黑素的分布和降解。

黑素是吲哚和醌與蛋白質(zhì)結(jié)合的高分子聚合物，具有超強(qiáng)的抗酸能力，對(duì)強(qiáng)堿也有一定耐受；溶酶體水解酶可以降解黑素小體黑素以外的成分，但黑素核的超微結(jié)構(gòu)仍很難被破壞［17］。隨著表皮KC的分化，其胞內(nèi)的黑素也不斷被降解［18］，黑素在KC內(nèi)的降解機(jī)制目前仍未完全闡明。

1. 溶酶體與黑素降解：溶酶體是膜結(jié)合細(xì)胞器，內(nèi)有50 多種酸性水解酶，通過(guò)內(nèi)吞、吞噬和自噬途徑降解大分子物質(zhì)［19］。黑素小體是一種溶酶體相關(guān)細(xì)胞器（LROs），其與內(nèi)涵體及溶酶體具有相同特征，具有酸性pH 和晚期內(nèi)涵體/溶酶體標(biāo)記物等［20］。既往研究證實(shí)［21?22］，黑素轉(zhuǎn)運(yùn)到KC后被膜包裹后降解。Hurbain等［7］及Correia等［8］的研究均發(fā)現(xiàn)，包裹黑素核的單層膜具有內(nèi)涵體/溶酶體的標(biāo)記蛋白LAMP2和CD63，黑素核周圍則被一些早期內(nèi)涵體標(biāo)記物所包裹；但研究同時(shí)也觀察到轉(zhuǎn)運(yùn)至KC內(nèi)的黑素核并未立即降解，可在KC 內(nèi)維持至少7 d，且KC 內(nèi)的黑素小體也不呈酸性。這提示大多數(shù)黑素小體并未被內(nèi)涵體/溶酶體水解酶活躍地降解，可能只是包裹在KC 特定的細(xì)胞器內(nèi)。Hurbain等［7］通過(guò)三維立體重建技術(shù)發(fā)現(xiàn)，KC內(nèi)黑素核與大量細(xì)胞器結(jié)構(gòu)接觸，包括粗面及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、來(lái)源不明的小管狀膜。推測(cè)這些接觸可能導(dǎo)致KC 內(nèi)黑素小體的膜重構(gòu)，從而可能調(diào)控黑素小體結(jié)構(gòu)和功能變化，在黑素降解中發(fā)揮作用。

2.自噬與黑素降解：自噬過(guò)程起始于細(xì)胞內(nèi)游離的吞噬泡，吞噬泡不斷延伸、融合，最終形成雙層膜的自噬體，自噬體或者內(nèi)涵體形成的自噬內(nèi)涵體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，被吞噬的物質(zhì)在自噬溶酶體內(nèi)降解［23］。研究［21?22，24］顯示，自噬可以調(diào)節(jié)KC 內(nèi)黑素水平，且淺膚色者的自噬水平更活躍。Hurbain等［7］在表皮角質(zhì)層中檢測(cè)到大量與自噬相關(guān)的微管相關(guān)蛋白輕鏈，但在KC和MC內(nèi)的黑素小體膜上并未檢測(cè)到。因此，推測(cè)自噬通路可能通過(guò)下游信號(hào)間接控制KC中黑素降解，且這些信號(hào)與膚色有關(guān)。Kim等［25］發(fā)現(xiàn)，微小miRNA?1299過(guò)度表達(dá)可抑制酪氨酸酶和精氨酸酶2（ARG2）表達(dá)，而敲除miRNA?1299后二者表達(dá)上調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃褐斑皮損處miRNA?1299 表達(dá)下調(diào)且ARG2 表達(dá)上調(diào)，推測(cè)ARG2 通過(guò)抑制KC 自噬功能減緩黑素小體降解，導(dǎo)致黃褐斑皮膚色素沉著發(fā)生。

3.組織蛋白酶V（CTSV）與黑素降解：溶酶體內(nèi)含有多種水解酶，CTSV 是溶酶體中的一種酸性水解酶，在降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究顯示［26］，CTSV在淺色皮膚中的表達(dá)顯著高于深色皮膚，表明淺色皮膚中的降解功能活躍。Yi等［5］發(fā)現(xiàn)，KC內(nèi)的CTSV對(duì)黑素核有水解作用，紫外線照射后KC 內(nèi)CTSV 的mRNA 表達(dá)和酶活性均顯著下降，黑素核的降解被抑制，導(dǎo)致色素沉著。Homma等［27］發(fā)現(xiàn)，正常皮膚CTSV在表皮全層均高度表達(dá)，而在色素沉著性皮損處基底層CTSV 表達(dá)顯著低于角質(zhì)層，黑素小體數(shù)量顯著增加；CSTV 基因敲除后，KC 內(nèi)黑素降解顯著受到抑制，推測(cè)CSTV可能在黑素降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

三、小結(jié)

近年來(lái)，關(guān)于黑素合成的信號(hào)機(jī)制已經(jīng)有了比較深入的研究，但黑素的轉(zhuǎn)運(yùn)以及在KC內(nèi)的降解機(jī)制尚未完全闡明；膚色深淺與KC 內(nèi)黑素的分布和數(shù)量有關(guān)，因此黑素轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過(guò)程的闡明對(duì)研究皮膚色素沉著具有重要作用。深入探討黑素轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的具體信號(hào)機(jī)制，可為黃褐斑等難治性色素性皮膚病提供新的治療方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突