陳晨，陸璨，陸前進(jìn)

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 1.胸外科 2. 口腔醫(yī)學(xué)中心 3.醫(yī)學(xué)表觀基因組學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

賁門(mén)腺癌（gastric cardia adenocarcinoma,GCA） 是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。GCA的流行病學(xué)特征是其與食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的發(fā)病地域分布性相一致[1-2]。近年來(lái)胃部腫瘤的發(fā)生率呈整體下降趨勢(shì)，而食管和胃交界部腫瘤的發(fā)病率則呈明顯上升趨勢(shì)，其原因主要與胃食管反流等因素相關(guān)[1,3]。統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)為早期GCA患者術(shù)后5年生存率約為80%，但中晚期患者5年生存率不足10%，最主要的原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移[4-5]。因此尋找有效的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物對(duì)于改善GCA患者生存時(shí)間至關(guān)重要。目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因累積變化或相互作用疊加的結(jié)果。其中癌基因突變和抑癌基因的失活是腫瘤形成的兩大重要因素，而抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化則是導(dǎo)致其功能失活的主要機(jī)制之一[6]。

SOX17基因定位于8q11.23，屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族。SOX基因家族是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子超家族，該家族的共同特征是均具有一個(gè)高度保守的HMG-box區(qū)域，與性別決定基因SRY具有高度同源性[7]。目前為止SOX基因家族共發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)成員，其主要功能是參與正常生理狀態(tài)下的性別決定、神經(jīng)發(fā)生、軟骨形成等一系列發(fā)育過(guò)程[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)某些SOX基因家族成員參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控，SOX17基因被認(rèn)為是β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)與TCF/LEF的相互作用，影響下游靶基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前已在多種腫瘤中觀察到了SOX17基因的表達(dá)失活，且其功能異常與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。本研究通過(guò)觀察GCA腫瘤組織，癌旁正常組織以及病理確證為腫瘤細(xì)胞陰性的淋巴結(jié)組織中SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，探索SOX17基因啟動(dòng)子甲基化與GCA腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系，對(duì)尋找GCA腫瘤診斷和預(yù)后分子標(biāo)記物具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2013年1月—2014年12月間本院手術(shù)切除的GCA標(biāo)本，其中腫瘤組織42例，對(duì)應(yīng)癌旁正常組織41例（缺失1例，癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5 cm外區(qū)域），以及相應(yīng)癌旁淋巴結(jié)組織79枚（盡量保證每例檢測(cè)2個(gè)淋巴結(jié)）均為石蠟包埋組織標(biāo)本。全部腫瘤組織均經(jīng)病理診斷為早期賁門(mén)腺癌，其中I期19例，II期23例。按照組織分化程度，高分化10例，中分化17例，低分化15例。所有淋巴結(jié)樣本均由病理免疫組化檢測(cè)確證為未見(jiàn)轉(zhuǎn)移癌的淋巴結(jié)。所有腫瘤患者中，男25例，女17例；年齡最小者55歲，最大68歲，中位年齡63.7歲；術(shù)前均未接受化療或放療。所有患者于術(shù)后進(jìn)行定期隨訪(fǎng)，中位隨訪(fǎng)時(shí)間39個(gè)月。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 DNA樣本提取和亞硫酸氫鈉修飾 為最大程度檢測(cè)石蠟標(biāo)本DNA中SOX17甲基化情況，本研究采用一種全新的基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)[12-14]，簡(jiǎn)述如下：取石蠟組織切片 10 μm 各 2～5片，加入 Incubation Buffer/Proteinase K 溶液（Promega公司）56℃孵育過(guò)夜，加入磁珠（Promega公司），充分混勻使DNA吸附于磁珠上；采用 Zymo 公司 EZ DNA Methylation kit試劑直接在磁珠上對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，最終獲得可直接用于后續(xù)PCR擴(kuò)增的DNA模板。

1.2.2 甲基化特異性PCR 擴(kuò)增 SOX17基因和內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增引物由上海Invitrogen 公司合成，具體引物序列如下。SOX17：上游引物5'-TTT AAC GAC GCG GGA TCG-3'， 下 游 引 物 5'-CCC AAC CGA CCT AAT AAC ACT ACG-3'，探針CGT TTT CGT CGT TTT ATT GGT TAT ATT TGT GTA G；β-actin： 上 游 引 物 5'-TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT-3'， 下 游 引 物 5'-AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC-3'，探針 CGA CTG CGT GTG GGG TGG TGA TGG AGG AGG TTT AGG CAG TCG。PCR 反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液 2.5μL；10 mmol/L dNTP 混合液0.5μL；50 mmol/L MgCl20.8μL；Platinum Taq DNA 聚合酶 0.2μL；上游及下游引物各 1μL；2μL 修飾后的 DNA 模板；雙蒸水 17μL；總體積共25μL。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán)45個(gè)周期；72℃終末延伸5min。每個(gè)樣本重復(fù) 3 遍，采 用 2-ΔΔCT法 判 斷 Real time PCR 陽(yáng) 性結(jié)果[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間均數(shù)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，腫瘤及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織甲基化差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法，采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織中SOX17基因啟動(dòng)子甲基化情況及與臨床病理因素的關(guān)系

在腫瘤組織和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中均能檢測(cè)到SOX17啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（圖1）。

42例GCA腫瘤組織中有31例（73.8%）檢測(cè)出SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性；41例正常組織中2例（4.9%）檢測(cè)出SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性（表1）；與正常組織比較，GCA腫瘤組織中SOX17甲基化發(fā)生率明顯高于正常組織（P＜0.001）；SOX17的甲基化與患者性別、年齡、飲酒史、腫瘤TNM分期及分化程度無(wú)關(guān)（表2）。

圖1 Real time PCR結(jié)果 A:腫瘤組織中SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性；B SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化陰性；C)淋巴結(jié)中SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性

表1 腫瘤組織與正常組織中SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化比率[n（%）]

表2 SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與GCA臨床病理特征的關(guān)系

2.2 淋巴結(jié)中SOX17基因啟動(dòng)子的甲基化

在腫瘤組織SOX17甲基化陽(yáng)性的GCA31例所對(duì)應(yīng)的淋巴結(jié)中，共有18例（共29枚淋巴結(jié)）檢測(cè)到SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化；在腫瘤組織SOX17甲基化陰性的11例中，相應(yīng)的淋巴結(jié)組織均未檢測(cè)到SOX17甲基化。

2.3 SOX17基因甲基化與腫瘤預(yù)后的關(guān)系

42例患者術(shù)后總的生存率為78.6%（圖2A）。生存分析顯示，在GCA腫瘤組織中，與SOX17甲基化陰性者比較，SOX17甲基化陽(yáng)性的患者預(yù)后不佳，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.14）（圖2B）；而在淋巴結(jié)中SOX17甲基化陽(yáng)性者，其生存時(shí)間明顯短于淋巴結(jié)中SOX17甲基化陰性者（P＜0.05）（圖2C）。

圖2 SOX17基因甲基化與生存的關(guān)系 A：42例GCA患者總體生存曲線(xiàn)；B：GCA腫瘤組織中檢測(cè)SOX17甲基化狀態(tài)與生存預(yù)后關(guān)系；C：淋巴結(jié)中檢測(cè)SOX17甲基化狀態(tài)與生存預(yù)后關(guān)系

3 討 論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下，該通路的關(guān)鍵調(diào)控基因，如APC、SOX17等基因可以通過(guò)抑制通路的活化阻止腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[15]。目前認(rèn)為SOX17基因?qū)nt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控并不依賴(lài)于通過(guò)與Wnt信號(hào)蛋白或其配體的結(jié)合來(lái)拮抗通路的激活，而是通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的相互競(jìng)爭(zhēng)，抑制或開(kāi)啟下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[16-18]。在對(duì)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化，基因表達(dá)失活。去除異常甲基化可以恢復(fù)SOX17的基因轉(zhuǎn)錄，抑制β-catenin誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。Balgkouranidou 和Oishi等[17,20]在 對(duì) 胃 癌 的 研 究中也觀察到SOX17的異常甲基化狀態(tài)，且血漿中SOX17的甲基化被認(rèn)為可以作為胃癌患者的預(yù)后判斷指標(biāo)[17,20]。這些都提示了SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。本研究顯示，GCA腫瘤組織中SOX17基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率為73.8%，明顯高于正常對(duì)照組的4.9%；在病理確證為腫瘤細(xì)胞陰性的癌旁淋巴結(jié)中，也能檢測(cè)到SOX17的甲基化異常，這些都提示了SOX17啟動(dòng)子區(qū)甲基化是GCA腫瘤發(fā)生中的重要事件。

研究[21-22]認(rèn)為，腫瘤作為一種全身性疾病，其DNA甲基化的異常改變并不僅僅局限于腫瘤細(xì)胞中。腫瘤發(fā)生時(shí)，在循環(huán)血、腫瘤引流淋巴結(jié)以及機(jī)體免疫細(xì)胞中均可觀察到與腫瘤變化趨勢(shì)一致的基因改變。Brock等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，早期肺癌患者術(shù)后病理確證為腫瘤陰性的淋巴結(jié)中可以檢測(cè)到DNA的異常甲基化，且這些異常的甲基化與腫瘤中的DNA甲基化變化趨勢(shì)相一致；聯(lián)合檢測(cè)腫瘤組織和相應(yīng)淋巴結(jié)中DNA甲基化的改變可以作為腫瘤預(yù)后的判斷指標(biāo)。這提示了檢測(cè)癌旁未發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中DNA甲基化狀態(tài)具有重要臨床意義。

在DNA甲基化的檢測(cè)過(guò)程中，亞硫酸氫鈉修飾是必不可少的關(guān)鍵步驟，但該步驟同時(shí)也會(huì)造成DNA的損傷和降解，極大降低了甲基化檢測(cè)的靈敏度。尤其是對(duì)于石蠟標(biāo)本和血漿標(biāo)本中的小片段DNA，即使采用巢式PCR，其檢測(cè)效果仍不能令人滿(mǎn)意。為了解決這一問(wèn)題，本研究采用一種全新的基于磁珠的亞硫酸氫鈉修飾處理方式，將DNA結(jié)合在磁珠上之后直接進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，最大程度減低了DNA的損失和降解，大大提高了檢測(cè)的靈敏度[12,14]。尤其是對(duì)于病理陰性的淋巴結(jié)組織，本研究在29枚淋巴結(jié)組織中檢測(cè)到了SOX17基因的甲基化，且淋巴結(jié)中SOX17甲基化陽(yáng)性的病例預(yù)后明顯不佳，提示了運(yùn)用這種全新的檢測(cè)方法在淋巴結(jié)中檢測(cè)SOX17啟動(dòng)子甲基化，對(duì)于GCA腫瘤預(yù)后判斷具有重要臨床意義。

綜上所述，本研究提示了SOX17基因甲基化在GCA腫瘤發(fā)生進(jìn)展中扮演重要角色；同期檢測(cè)腫瘤組織和相應(yīng)淋巴結(jié)中DNA甲基化狀態(tài)對(duì)早期GCA腫瘤預(yù)后的判斷具有重大意義。

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