陳素琴，袁海洪

(武清區(qū)人民醫(yī)院病理科，天津 301700)

ERα、ERβ和EGFR在人肺癌組織芯片中的表達(dá)和意義

陳素琴，袁海洪

(武清區(qū)人民醫(yī)院病理科，天津 301700)

目的 探討雌激素受體α(ERα)和β(ERβ)及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在肺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)及意義。方法選取癌前病變組(不典型腺瘤樣增生)12例，原發(fā)肺癌組77例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組12例構(gòu)建成進(jìn)展組織芯片。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ERα、ERβ和EGFR在此芯片中的表達(dá)，并探討其相互關(guān)系。結(jié)果在進(jìn)展組織芯片癌前病變組、原發(fā)肺癌組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組中ERα的表達(dá)陽(yáng)性率分別為91.67%、62.34%和25.00%，不同組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；ERβ的表達(dá)陽(yáng)性率分別為91.67%、55.84%和16.67%，不同組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率分別為25.00%、59.74%和91.67%，不同組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在原發(fā)肺癌中，ERα表達(dá)與性別、組織學(xué)分型、腫瘤分化程度及P-TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，ERβ表達(dá)與性別、組織學(xué)分型、腫瘤分化程度、P-TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，EGFR表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的P-TNM分期有關(guān)(P＜0.05)。ERβ和EGFR的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.612，P＜0.01)。結(jié)論ERα、ERβ及EGFR均與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且ERβ和EGFR的表達(dá)相關(guān)，這種潛在的機(jī)制及關(guān)聯(lián)性為將來(lái)的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

組織芯片；免疫組織化學(xué)；肺癌；雌激素受體α；雌激素受體β；表皮生長(zhǎng)因子受體

雌激素在多種腫瘤中的促癌作用已經(jīng)得到證實(shí)。雌激素受體(ER)的表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)屬于酪氨酸激酶家族，在多種癌癥中有過(guò)表達(dá)，包括肺癌[1]。相對(duì)于男性而言，女性肺癌對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療的反應(yīng)更好一些[2]，這表明EGFR和ER之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。本研究目的在于探討雌激素受體ERα、ERβ及EGFR在我國(guó)肺癌進(jìn)展組織芯片中的表達(dá)情況及其與肺癌的臨床特點(diǎn)的關(guān)系，以及三者在肺癌中表達(dá)的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取肺癌手術(shù)切除標(biāo)本，癌前病變(不典型腺瘤樣增生)12例，原發(fā)肺癌77例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌12例。此77例原發(fā)肺癌標(biāo)本臨床資料完整，其中腺癌35例，鱗癌33例，大細(xì)胞癌9例(按2004年WHO肺癌組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn))；男性58例，女性19例；年齡45～75歲，中位年齡6l歲；周?chē)?1例，中央型26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例；高、中分化46例，低、未分化31例；Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期29例(根據(jù)P-TNM分期)。所有病例在腫瘤切除前均未進(jìn)行放療和化療。

1.2 組織芯片制作方法 在顯微鏡下找出腫瘤組織切片中有代表性的區(qū)域，并在相應(yīng)石蠟包埋組織切面上做標(biāo)記。用0.6 mm組織穿刺針在每個(gè)標(biāo)本的標(biāo)記點(diǎn)分別取樣，而后將其依次排列于模具內(nèi)預(yù)融的石蠟中構(gòu)成組織微陣列蠟塊，待石蠟?zāi)毯笄兄?～4 μm組織微陣列切片，將其粘附于玻片上，封蠟，4℃保存。

1.3 免疫組化Elivision兩步法 單克隆兔抗人EGFR抗體為博士德生物公司產(chǎn)品，工作液濃度為1: 100；單克隆鼠抗人ERα抗體為基因科技有限公司產(chǎn)品，工作液濃度為1:100；多克隆兔抗人ERβ抗體為北京Bioss生物技術(shù)公司產(chǎn)品，工作液濃度為1:200；即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 對(duì)組織芯片中各點(diǎn)評(píng)分，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積兩者積分之和來(lái)判斷。染色強(qiáng)度定性積分為：不著色為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；染色面積定量積分：無(wú)著色或＜5%為0，5%～24%為1，25%～50%為2，＞50%為3；兩種積分相加為該點(diǎn)得分。對(duì)組織芯片中來(lái)自同一病例的各點(diǎn)的得分相加取平均值，依照0為-，1～2為+，3～4為++，5～6為+++，進(jìn)行半定量判斷；＞2(++和+++)為陽(yáng)性，≤2(-和+)為陰性進(jìn)行定性判斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包，臨床病理參數(shù)間的比較采用行×列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法、四格表χ2檢驗(yàn)計(jì)算；顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。ERα、ERβ和EGFR之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 肺癌進(jìn)展組織芯片中ERα、ERβ和EGFR的表達(dá)差異 ERα陽(yáng)性著色位于細(xì)胞核(圖1)，ERβ陽(yáng)性著色位于細(xì)胞核(圖2)，EGFR陽(yáng)性著色位于細(xì)胞漿/膜(圖3)。ERα和ERβ在癌前病變中的表達(dá)高于原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌，在原發(fā)肺癌中的表達(dá)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌。在癌前病變、原發(fā)肺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌中ERα和ERβ的表達(dá)陽(yáng)性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。EGFR蛋白在癌前病變中的表達(dá)低于原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌，在原發(fā)肺癌中的表達(dá)低于于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌。在癌前病變、原發(fā)肺癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌中EGFR的表達(dá)陽(yáng)性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

圖1 ERα肺腺癌細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)(Elivision×100)

圖2 ERβ肺鱗癌細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)(Elivision×100)

圖3 EGFR肺腺癌細(xì)胞漿/膜(Elivision×100)

表1 肺癌進(jìn)展組織芯片中ERα、ERβ和EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率比較[例(%)]

2.2 原發(fā)肺癌中ERα、ERβ和EGFR的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 ERα、ERβ和EGFR在77例原發(fā)肺癌中的表達(dá)陽(yáng)性見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，ERα和ERβ的表達(dá)與性別有關(guān)，在女性中的表達(dá)陽(yáng)性率高于男性(P＜0.05)。ERα和ERβ蛋白的表達(dá)還與肺癌的組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)，在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌(P＜0.05)，在大細(xì)胞癌中的表達(dá)低于腺癌和鱗癌，但這種差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ERα和ERβ的表達(dá)陽(yáng)性率隨腫瘤分化程度的升高呈上升趨勢(shì)，在腫瘤高、中分化組的表達(dá)陽(yáng)性率高于低、未分化組(P＜0.05)。ERα和ER的表達(dá)陽(yáng)性率隨著P-TNM分期的進(jìn)展呈下降趨勢(shì)，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達(dá)陽(yáng)性率高于于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。ER β的表達(dá)與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)陽(yáng)性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率與P-TNM分期有關(guān)，隨著P-TNM分期的進(jìn)展呈上升趨勢(shì)，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達(dá)陽(yáng)性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。ERα的表達(dá)陽(yáng)性率與患者年齡、肉眼類(lèi)型及腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。ERβ的表達(dá)陽(yáng)性率與患者年齡和肉眼類(lèi)型無(wú)關(guān)(P＞0.05)。EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率與患者的性別、年齡、肉眼類(lèi)型、組織學(xué)分型及腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

表2 ERα、ERβ和EGFR在77例原發(fā)肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 原發(fā)肺癌中ERα、ERβ和EGFR之間的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，在原發(fā)肺癌中，ERβ和EGFR蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.612，P＜0.01)，ERα和ERβ、ERα和EGFR之間的表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系(rERα-ERβ=-0.058，P＞0.05；rERα-EGFR=-0.040，P＞0.05)。

3 討 論

肺癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，但是總體治療效果并不滿(mǎn)意。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，ER在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的確起著重要作用[3]。ER有兩種亞型，即ERα和ERβ。ERα在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)情況在國(guó)內(nèi)外各文獻(xiàn)之間報(bào)道的差異較大，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均有陽(yáng)性表達(dá)的報(bào)道[4]，而表達(dá)的陽(yáng)性率也不同，本研究中ERα蛋白表達(dá)于癌前病變、原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌的細(xì)胞核。與Yun等[5]的報(bào)道一致。He等[6]認(rèn)為在肺癌中不表達(dá)全長(zhǎng)的ERα，但是檢測(cè)到了變異的ERα。這可能是由于不同的檢測(cè)方法、不同的抗體及ERα自身的變異造成的。對(duì)于ERβ蛋白在肺癌中的定位研究較一致，為細(xì)胞核。本研究中ERβ蛋白表達(dá)于癌前病變、原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌的細(xì)胞核。Mah等[7]認(rèn)為ERβ的表達(dá)提示肺癌患者有長(zhǎng)期的生存率。本研究結(jié)果顯示ERα和ERβ在癌前病變、原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌的表達(dá)越來(lái)越低，隨著腫瘤細(xì)胞分化程度的升高而上升，隨著臨床分期的進(jìn)展而降低(P＜0.05)；ERβ在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，提示兩者的失表達(dá)可能與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，從另一方面支持了以上說(shuō)法。McHugh等[8]在分子水平的研究顯示ERα mRNA在肺癌女性患者中的表達(dá)明顯高于男性。本研究用免疫組化的方法在蛋白水平得到類(lèi)似的結(jié)果，ERα和ERβ蛋白在肺癌女性患者中的表達(dá)明顯高于男性，與Luo等[9]的研究一致。此外，本研究對(duì)ERα和ERβ在不同肺癌組織學(xué)分型的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌(P＜0.05)，與McHugh等[8]和Luo等[9]的研究相符，提示了ERα和ER β應(yīng)用于肺癌靶向治療的可能性。

ERβ與ERα在氨基酸序列和配體結(jié)合域有同源性，編碼基因所在染色體不同，ERα位于6q25.1，ERβ位于14q23.2。ERα與ERβ在通過(guò)增強(qiáng)子元件的信號(hào)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中介導(dǎo)的配體效應(yīng)截然不同[10]。本研究結(jié)果顯示，ERα和ERβ在肺癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系。因此可以推測(cè)，ERα和ERβ可能在基因調(diào)控中起不同作用。

EGFR屬于細(xì)胞表面酪氨酸蛋白激酶受體erbB家族成員，是原癌基因c-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，參與調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖、腫瘤血管生成，促進(jìn)細(xì)胞遷移和分化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)癌前病變、原發(fā)肺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中EGFR表達(dá)陽(yáng)性率隨肺癌的進(jìn)展而升高，EGFR蛋白的表達(dá)隨臨床分期的進(jìn)展而表達(dá)升高，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)與顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)，表明其在肺癌的發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起到了促進(jìn)的作用，對(duì)這些指標(biāo)的檢測(cè)有可能為估計(jì)患者預(yù)后提供重要信息。有文獻(xiàn)報(bào)道ER(包括ERα和ERβ)與EGFR之間有相互的作用[12]。這表明他們之間存在著共同的信號(hào)通路，而這些信號(hào)通路有可能為肺癌的生物學(xué)機(jī)制提供新的思路。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ERβ與EGFR在肺癌的表達(dá)中呈正相關(guān)，而ERα與EGFR卻沒(méi)有明顯的相關(guān)性，推測(cè)雌激素誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的增殖可能是通過(guò)ERβ來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，雌激素受體ERα和ERβ及EGFR均與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且ERβ和EGFR的表達(dá)相關(guān)，這種潛在的機(jī)制及關(guān)聯(lián)性可能為將來(lái)的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

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Expression and significance of estrogen receptor α,estrogen receptor β,and epidermal growth factor receptor in human lung cancer by tissue microarray.

CHEN Su-qin,YUAN Hai-hong.Department of Pathology,the People's Hospital of Wuqing District of Tianjin,Tianjin 301700,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and biological significances of estrogen receptor α(ERα), estrogen receptor β(ERβ),and epidermal growth factor receptor(EGFR)in lung cancer.MethodsWe constructed a tissue microarray in which there were 12 cases of precancerous lesion,77 cases of primary lung cancer,and 12 cases of lung cancer with lymph node metastasis,and detected the expression of ERα,ERβ and EGFR in these specimens by using Elivision immunohistochemical method.ResultsThe positive rate of ERα was 91.67%in precancerous tissues, 62.34%in primary lung cancer and 25.00%in lung cancer with lymph node metastasis,and there were significant differences among them(P＜0.01).The positive rate of ERβ was 91.67%in precancerous tissues,55.84%in primary lung cancer and 16.67%in lung cancer with lymph node metastasis,and the differences were statistically significant(P＜0.01). The positive rate of EGFR was 25.00%,59.74%,and 91.67%,respectively,and the differences among them were significant(P＜0.01).In primary lung cancer,the expression of ERα was significantly correlated with gender,histological types,grade and P-TNM stage(P＜0.05),and the expression of ERβ was significantly correlated with gender,histological types,grade,P-TNM stage and lymph node metastasis(P＜0.05).The expression of EGFR was significantly correlated with lymph node metastasis and P-TNM stage(P＜0.05).Correlation analysis showed that there was a positive correlation between ERβ and EGFR(r=0.612,P＜0.01).ConclusionThe expression of ERα,ERβ and EGFR are related to the occurrence and development of lung cancer,and the expression of ERβ is correlated with EGFR.The underlying mechanism and potential translational relevance provide the foundation for further investigation.

Tissue microarray;Immunohistochemical;Lung cancer;Estrogen receptor α(ERα);Estrogen receptor β(ERβ);Epidermal growth factor receptor(EGFR)

R734.2

A

1003-6350（2017）04-0521-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.002

2016-09-19)

天津市武清區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：WQKJ201214）

陳素琴。E-mail：sukeyar@163.com