肖瑛琦，陳 琪，蘇 松，付文廣，謝 鑫，鄭思琳△

(西南醫(yī)科大學(xué):1.附屬醫(yī)院護理部；2.護理學(xué)院；3.附屬醫(yī)院肝膽外科；4.附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000)

金口寶對兔口腔潰瘍模型的影響*

肖瑛琦1,2，陳 琪1，蘇 松3，付文廣3，謝 鑫4，鄭思琳1△

(西南醫(yī)科大學(xué):1.附屬醫(yī)院護理部；2.護理學(xué)院；3.附屬醫(yī)院肝膽外科；4.附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的 探討金口寶對兔口腔潰瘍的治療效果及其作用機制。方法 在60只實驗用SPF級新西蘭大白兔中隨機抓取6只作為潰瘍模型的鑒定，其余隨機等分為3組：對照組(NC組)、生理鹽水藥膜組(NS組)、金口寶藥膜組(JK組)。用40%的冰醋酸溶液燒灼兔口腔頰膜復(fù)制口腔潰瘍模型。觀察在造模當(dāng)天及給藥的第3、5、7天兔口腔潰瘍的變化情況，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測兔口腔頰部黏膜組織中表皮生長因子(EGF)水平，使用HE染色觀察兔口腔潰瘍局部病理組織學(xué)變化。結(jié)果 與NS組比較，在給藥的第3、5、7天JK組可以顯著減小潰瘍面積(P<0.01)。與NC組比較，NS組、JK組兔口腔頰部黏膜組織中EGF水平明顯升高(P<0.01)，但JK組EGF水平較NS組升高快，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在給藥的第3、5、7天，兔口腔潰瘍HE染色切片顯示，JK組較NS組炎癥細胞明顯減少，成纖維細胞明顯增生，上皮增生情況良好。結(jié)論 金口寶可以明顯改善兔口腔潰瘍癥狀并促進潰瘍愈合，金口寶可能是通過調(diào)節(jié)口腔潰瘍時EGF水平而增強口腔潰瘍的修復(fù)能力。

金口寶；口腔潰瘍；表皮生長因子；動物實驗

口腔潰瘍,又稱“口瘡”，是發(fā)生在口腔黏膜上的表淺性潰瘍，大小可以從米粒至黃豆大小，成圓形或卵圓形，潰瘍周圍充血[1]，局部疼痛，主要發(fā)生在唇、頰、舌緣等部位，往往反復(fù)發(fā)作、久治不愈，給患者帶來痛苦，影響患者的工作與生活。目前，治療口腔潰瘍以藥物治療為主，但效果仍不夠理想[2]。金口寶是一類由中藥(金銀花、梔子、白芷、白茅根、桔梗、玉竹、甘草等)精制而成的含片，目前主要用于治療口腔潰瘍、牙周炎等口腔疾患，然而，治療口腔潰瘍的機制尚未明確。因此，本研究通過實驗性口腔潰瘍兔在應(yīng)用金口寶藥膜后，觀察其癥狀及口腔頰部黏膜組織中表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的變化，來探討金口寶治療口腔潰瘍的機制，為金口寶臨床用藥治療口腔潰瘍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選SPF級新西蘭兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量3 000～3 500 g，購于瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[許可證號：SYXK(川)2013-065]，顆粒飼料飼養(yǎng)，保證充足飲水，室溫(20±2)℃，平均相對濕度(40～60)%。

1.1.2 實驗藥品及試劑 羥丙基甲基纖維素購自浙江湖州展望天明有限公司，金口寶含片購自壽世保元食品有限公司，吐溫-80購自百世化工有限公司，甘油購自永大化學(xué)試劑有限公司，冰乙酸購自金山化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit購自博奧森生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自博奧森生物技術(shù)有限公司，RNA抽提試劑盒購自美國InvitroGen公司，2×TaqPCR MasterMix購自中國天根生化科技有限公司，DNA Master購自日本TaKaRa公司，99%精鹽購自SiGma-Aldrich西格瑪奧德里奇有限公司。

1.1.3 實驗儀器 組織勻漿器購自美國Cole-Parmer公司，自動染色機購自德國Leica公司，病理切片機購自德國Leica公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，超低溫冰箱購自德國Eppendorf公司，Mini-H3垂直電泳儀購自美國Biorad 公司，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)LAS-3000購自日本富士公司，紫外分光光度計ND-1000購自美國NanoDrop公司，高速多功能冷凍離心機購自THERMO公司，超低溫冰箱(-80 ℃)購自美國Biorad公司，Maxi-MixII試管震蕩器購自美國BarNSGtead/Thermolyne公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)購自武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 金口寶藥膜的制備：取金口寶含片600 g，吐溫-80 5.0 mL，甘油20.0 mL，加飽和羥丙甲基纖維素液至1 000 mL，玻棒攪拌至充分溶解成凝膠狀，靜置24 h后均勻鋪盤，待干后將其切成直徑1 cm的藥膜貼，紫外線照射消毒，聚乙烯薄膜密封備用。生理鹽水藥膜的制備：取精鹽9 g,加飽和羥丙甲基纖維素液至1 000 mL，其余方法同金口寶藥膜。

1.2.2 動物分組 60只實驗用SPF級新西南大白兔，將所有兔按照體質(zhì)量大小進行編號，采用隨機數(shù)字表的方法在樣本兔中隨機抽取6只作為潰瘍模型的鑒定(模型組)，其余按照相同的方法隨機等分為3組：對照組(NC組)，不建立潰瘍模型，也不做任何處理；生理鹽水藥膜組(NS組)，建立潰瘍模型，并給予生理鹽水藥膜治療；金口寶藥膜組(JK組)，建立潰瘍模型，并給予金口寶藥膜治療。每組18只(雌雄各半)。

1.2.3 模型制備 用3%的戊巴比妥鈉(注射劑量為30 mg/kg[3])將需要建膜的兔麻醉，將直徑為8 mm的玻棒(玻棒長度為10 cm)蘸取濃度為40%的冰醋酸置于兔左右兩側(cè)距口角2 mm頰膜處燒灼60 s,生理鹽水沖洗1 min，使局部成灰白色，直徑8 mm的白色損害，24 h后肉眼可見兔口腔頰部充血、紅腫，黃或白色假膜覆蓋，潰瘍模型形成。

1.2.4 給藥 模型建立后各組開始給藥。NC組、模型組不作處理；NS組用生理鹽水藥膜貼敷兔口腔潰瘍面；JK組用金口寶藥膜貼敷兔口腔潰瘍面。每天2次(分別在9：00與17：00)，兩側(cè)1次均1片藥膜，每次5 min，然后以溫生理鹽水清洗用藥局部，連續(xù)7 d。

1.2.5 指標觀測 (1)兔癥狀體征變化：兔癥狀體征請本課題另一名未參與造模和分組成員B(定人)肉眼觀察為主。觀察指標為兔活動情況、體質(zhì)量、大小便、毛色、進食等情況的變化。(2)兔潰瘍形態(tài)變化及面積測定：在建模成功當(dāng)天(0 d)處死用于潰瘍模型鑒定的兔； NC組、NS組、JK組中以隨機數(shù)字表方法在用藥后的第3、5、7天隨機處死6只兔。課題組成員B觀察兔口腔潰瘍的形態(tài)，如充血情況，口腔黏膜色澤，有無假膜覆蓋等。將處死的各組兔，嘴巴剪開，充分暴露整個口腔，選取口腔黏膜(以潰瘍和正常黏膜交界處的組織為宜)[3]，用游標卡尺測量潰瘍大小，用Imageconverter軟件計算潰瘍面積(定人B、定位置、定焦聚照相)。(3)兔口腔頰部黏膜組織中EGF水平的測定：將切取的潰瘍病區(qū)病理標本，右側(cè)置于10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，左側(cè)立即液氮速凍，以防m(xù)RNA降解，然后送實驗室-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，用RT-PCR方法檢測EGF mRNA的表達量，Quantity One軟件計算比較RT-PCR產(chǎn)物條帶與β-actin條帶的光密度的相對比值。(4)兔潰瘍局部病理組織學(xué)變化：將石蠟包埋的標本切片進行HE染色，觀察各組兔口腔潰瘍組織形態(tài)(NC組取口腔潰瘍相應(yīng)位置的局部組織)。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔癥狀體征變化比較 造模前及NC組兔口唇干燥，活動正常，反應(yīng)靈活，食欲良好，毛色光澤順滑，小便淡黃，大便正常；造模后口唇邊潮濕、偶有流口水，活動減少，精神較差，攝食量飲水量減少，體質(zhì)量減輕，毛色較之前黯淡粗糙，小便黃且量少，大便減少。JK組經(jīng)金口寶治療后逐漸恢復(fù)，飲食、飲水增加，體質(zhì)量逐漸回升，口唇較之前干燥，毛色逐漸光滑，活動逐漸增加，大小便逐漸趨于正常。NS組恢復(fù)速度較JK組慢。

2.2 NS、JK組兔潰瘍形態(tài)及面積變化比較 NC組口腔黏膜光整，色淡紅，有光澤。冰醋酸燒灼24 h后，兔口腔頰部形成圓形或橢圓形的潰瘍，直徑約8 mm，邊緣整齊，周邊紅腫充血，表面有黃色或灰白色假膜覆蓋。隨著時間推移，口腔黏膜充血水腫逐漸減輕，逐漸恢復(fù)光澤，JK組恢復(fù)情況較NS組好。在建模成功第1天JK組潰瘍面積與NS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在用藥的第3、5、7天，JK組潰瘍面積明顯小于NS組(P<0.05)，見表1。

表1 NS、JK組兔不同時間潰瘍面積比較

a：P<0.05，與NS組比較。

2.3 各組兔口腔頰部黏膜組織中EGF水平比較 EGF mRNA在NC組中少量表達，與NS、JK組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，NS組與JK組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在用藥后第3、5、7天，NS組、JK組中EGF的表達水平逐漸升高，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖1。

表2 各組兔口腔黏膜EGF mRNA水平比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與NS組比較。

圖1 口腔黏膜EGF mRNA表達

2.4 光鏡觀察兔頰黏膜病理組織學(xué)變化 細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈淡紅色。NC組兔口腔黏膜上皮完整覆蓋，下方是由致密結(jié)締組織組成的固有層，未見明顯炎性細胞浸潤。NS、JK組兔用藥3 d后，黏膜上皮細胞壞死脫落，NS組炎癥細胞數(shù)目較多，幾乎看不到新生的成纖維細胞；JK組炎癥細胞數(shù)目明顯減少，有少量新生的成纖維細胞。用藥5 d后，NS組炎癥細胞數(shù)目開始減少；JK組炎癥細胞數(shù)目不斷減少，可以看到許多新生的成纖維細胞。用藥7 d后，NS組炎癥細胞數(shù)目明顯減輕,且有許多新生的成纖維細胞；JK組表面幾乎被黏膜上皮覆蓋，潰瘍在趨于愈合，見圖2。

A：模型組0 d；B：NC組1 d；C：NS組用藥3 d；D：JK組用藥3 d；E：NS組用藥5 d；F：JK組用藥5 d；G：NS組用藥7 d；H：JK組用藥7 d。

圖2 各組兔頰黏膜HE染色(×200)

3 討 論

近年來，口腔潰蕩的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，可發(fā)生于任何年齡，但以青壯年為多[1],潰瘍發(fā)生時，口腔黏膜上皮結(jié)構(gòu)消失，被大量炎性細胞浸潤，表皮細胞發(fā)生上皮破壞脫落，局部疼痛，當(dāng)遇到酸、咸、熱、辣等刺激時疼痛加重，給患者帶來困擾。目前，用于治療口腔潰瘍的藥品種類繁多，多是對癥治療或者采用增強免疫的藥物[4]。隨著中醫(yī)的發(fā)展，中藥臨床治療一些疾病的療效得到了較為廣泛的認可。中醫(yī)認為口腔潰瘍的發(fā)生與“火”相關(guān)，據(jù)“火”之虛實，可首分為虛實，實證常見脾胃伏火、心火上炎、心脾積熱、脾虛濕困；虛證常見陰虛火旺、脾腎虛弱[4]。

金口寶是一類由中藥(金銀花、梔子、白芷、白茅根、桔梗、玉竹、甘草等)精制而成的含片。金銀花味甘微苦，性寒，善清利上焦和肌表之毒邪；此外，金銀花因其含綠原酸類、黃酮類化合物及揮發(fā)油等成分，具有抗炎、抑制多種病原菌、抗病毒、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。梔子，味苦性寒，歸心、肝、肺、胃、三焦經(jīng)，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效[6]。白芷味辛微苦，性溫，氣芳香，有祛風(fēng)濕，活血排膿，生肌止痛的功效[7]。白茅根涼血止血，消腫利尿，清熱解毒[8]。桔梗能宣肺泄邪以利咽開音；性散上行，能利肺氣以排壅肺之膿痰，鎮(zhèn)咳、解熱，還有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛，降血糖，降膽固醇，增強抗炎和免疫的作用[9]。玉竹味甘，性微寒，入肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰、潤燥、除煩、止渴的功效[10]。甘草味甘，性平，歸十二經(jīng)，補脾益氣，滋咳潤肺，緩急解毒，能調(diào)和百藥[11]。綜觀金口寶配方，既有瀉火清熱的治本之功，又有止痛、滋陰、除煩的治標之效。

本研究顯示金口寶可以有效改善實驗性口腔潰瘍兔的體征，緩解局部組織的炎癥反應(yīng)，減少滲出，促進潰瘍面的快速恢復(fù)，縮短潰瘍時間。EGF具有誘導(dǎo)細胞生長和增殖的作用[12]。有研究表明，在口腔黏膜的保護屏障中EGF起著重要的作用，為口腔黏膜上皮細胞的生長、分化和增殖提供基礎(chǔ)[13]，尤其與黏膜基底細胞增殖的關(guān)系更為密切[14]?？谇粷兊幕颊叱霈F(xiàn)EGF的短缺，這造成了口腔潰瘍的遷延不愈[15]。本研究顯示，造模成功當(dāng)天，EGF mRNA在NC組中少量表達(0.23±0.03)，較NS、JK組(0.44±0.03)少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NS組與JK組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示EGF mRNA的表達在潰瘍出現(xiàn)時隨即增加。在用藥的第3、5、7天，NS組與JK組EGF mRNA的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明金口寶能夠增強口腔黏膜EGF mRNA基因的表達，促進EGF的分泌；且隨著時間的推移，EGF mRNA的表達量逐漸增多，提示EGF參與了口腔潰瘍愈合的過程。有研究表明，在潰瘍患者口腔黏膜中EGF分泌減少，使口腔潰瘍的恢復(fù)受到阻礙[16]。因此，可以認為金口寶通過促進口腔黏膜中EGF的分泌，提高了口腔潰瘍自我修復(fù)的能力，促進潰瘍面愈合。

本研究通過觀察實驗性口腔潰瘍兔的癥狀體征、潰瘍形態(tài)面積、病理變化、EGF的分泌情況，對3組兔口腔潰瘍恢復(fù)情況進行觀察比較，表明金口寶能夠提高口腔黏膜細胞的自我修護能力，縮短潰瘍時間，加速潰瘍面愈合，其作用機制可能與促進EGF的分泌有關(guān)，為金口寶的臨床用藥提供了實驗依據(jù)與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model*

XiaoYingqi1，2,ChenQi1,SuSong3,FuWenguang3,XieXin4,ZhengSilin1△

(1.DepartmentofNursing,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.NursingCollege,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 4.DepartmentofHematoloyg,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the therapeutic effect of Jinkoubao on oral ulcer in rabbits and its action mechanism.Methods Among 60 SPF New Zealand rabbits,6 cases were randomly selected for the ulcer model identification,and the rest was randomly and equally divided into 3 groups:the control group (NC group),normal saline drug film group (NS group) and Jinkoubao film group (JK group).The rabbit model of oral ulcer was constructed by applying 40% glacial acetic acid to burn rabbit oral mucosa for duplicating the oral ulcer model.of the change situation of oral ulcer was observed on the same day for constructing model,on 3,5,7 d after medication.The EGF level in oral mucosal tissue was detected by using RT-PCR and the local histopathological changes in oral ulcer was observed by using HE staining method.Results Compared with the NS group,the ulcer area on 3,5,7 d after medication in the JK group was significantly deceased (P<0.01).Compared with the NS group,the EGF level in oral buccal mucosal tissue in the NS group and JK group was markedly increased (P<0.01).But the EGF level increase in the JK group was faster than that in the NS group,the difference was statistically significant(P<0.01).The HE staining section of rabbit oral ulcer on 3,5,7 d after medication showed that the inflammatory cells decrease in the JK group was more obvious than that in the NS group,fibroblasts proliferation was obvious and epithelial hyperplasia was good.Conclusion Jinkoubao could greatly improve the symptoms of oral ulcer in rabbits and promotes its healing,which is possible to strengthen the repair capacity of oral ulcer by regulating the EGF level.

Jinkoubao;oral ulcer;epidermal growth factor;animal experimentation

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.007

四川省科技廳(苗子工程)資助項目[川科發(fā)計(2014)10號]。 作者簡介：肖瑛琦(1991-)，在讀碩士研究生，主要從事臨床護理及護理教育研究?！?/p>

，E-mail：zhengsilin@yahoo.cn。

R285.5

A

1671-8348(2017)07-0886-03

2016-08-22

2016-11-05)