于有江，彭建明，葉記林，蘇蘭娣，羅 雪

(揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

蛇床子素對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的作用研究*

于有江，彭建明#，葉記林，蘇蘭娣，羅 雪

(揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

目的 探討蛇床子素對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡的作用及可能的機(jī)制。方法 經(jīng)不同濃度蛇床子素處理體外培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，半定量RT-PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA 的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，不同濃度的蛇床子素均可明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低Bcl-2/Bax的表達(dá)比例，且具有一定的劑量依賴性。結(jié)論 蛇床子素抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與升高細(xì)胞ROS水平、促進(jìn)激活促凋亡因子Bax的表達(dá)和抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

宮頸腫瘤；蛇床子素；細(xì)胞凋亡

蛇床子素(Osthole)是從中藥蛇床子中提取的一種香豆素，其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，具有多種藥理學(xué)和生物化學(xué)活性[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，蛇床子素具有多種藥理學(xué)功能，不僅能保護(hù)肝臟、保護(hù)神經(jīng)、抗骨質(zhì)疏松、抗炎等，還有較強(qiáng)的抗癌活性[2-4]。目前為止關(guān)于蛇床子素在宮頸癌中的研究較少，本研究以人宮頸癌細(xì)胞Hela為模型，觀察蛇床子素抗宮頸癌的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。蛇床子素購自上海詩丹德生物公司(純度98%)，用二甲基亞砜(DMSO)配成200 mmol/L 的貯存液；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為AMRESO產(chǎn)品；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于以下各實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后按分組要求加入不同劑量的蛇床子素(20、40、80、120、160、200 μmol/L)，溶劑對照組加等體積的0.1%DMSO，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對照(對照組)。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT。培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解反應(yīng)產(chǎn)物，在酶標(biāo)儀上檢測492 nm的吸光度值(OD)。抑制率計(jì)算如下：

抑制率=(1-OD藥物組/OD對照組)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將各處理組(蛇床子素100、150、200 μmol/L)細(xì)胞用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后用500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，并加入Annexin V和碘化丙啶(PI)輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 DCFH-DA法觀察細(xì)胞ROS水平 采用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測。取經(jīng)蛇床子素處理48 h后的Hela細(xì)胞，胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，加入DCFH-DA溶液，37 ℃孵育30 min后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的ROS水平。

1.2.5 RT-PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá) 取經(jīng)蛇床子素處理48 h后的Hela細(xì)胞，用TRIzol 抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)，取適量cDNA為模板，PCR法檢測Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，進(jìn)行組間差異比較。引物如下：Bcl-2上游引物為5′-GGT CGC CAG GAC CTC GCC GC-3′，下游引物為5′-AGT CGT CGC CGG CCT GGC G-3′；Bax上游引物為5′-GAG CTG CAG AGG ATG ATT GC-3′，下游引物為5′- AGC CCA ACA GCC GCT CCC GG-3′；GAPDH上游引物為5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′，下游引物為5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′。

2 結(jié) 果

2.1 各組腫瘤細(xì)胞增殖率比較 通過MTT法觀察不同濃度蛇床子素對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，蛇床子素對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，蛇床子素各劑量組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且隨藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，見圖1。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖1 蛇床子素處理后對Hela細(xì)胞增殖的作用

A：對照組；B：100 μmol/L組；C：150 μmol/L組；D：200 μmol/L組。

圖2 各處理組細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.2 各組宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡率比較 Annexin V和PI雙染各處理組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，100 μmol/L蛇床子素處理宮頸癌Hela細(xì)胞48 h后其凋亡率為(4.42 ± 1.94)%，與對照組(4.34 ± 0.26)%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；150 μmol/L和200 μmol/L蛇床子素處理宮頸癌Hela細(xì)胞48 h后其凋亡率分別為(9.66 ± 0.12)%和(41.51 ± 0.30)%，與對照組(4.34 ± 0.26)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 各組Hela細(xì)胞ROS水平比較 利用DCFH-DA法觀察細(xì)胞ROS水平，結(jié)果顯示，100、150、200 μmol/L蛇床子素處理組細(xì)胞內(nèi)ROS為(1.26±0.04)%、(2.15±0.14)%和(3.12±0.42)%，與對照組(1.00±0.05)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖3 各組Hela細(xì)胞ROS水平比較

2.4 蛇床子素對宮頸癌Hela細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響 蛇床子素處理48 h后，RT-PCR 檢測Bcl-2和Bax mRNA 的表達(dá)，與對照組比較，各蛇床子素藥物處理組Bcl-2 mRNA 表達(dá)量下降，而Bax mRNA 表達(dá)量明顯升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A：對照組；B：150 μmol/L組；C：200 μmol/L組；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

圖4 RT-PCR測定各組Hela細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)

3 討 論

蛇床子素具有比較廣譜的抗癌作用，對包括胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、白血病、前列腺癌、肺癌等都具有較好的抗癌活性[4-9]。但對于蛇床子素在宮頸癌中的抗癌作用研究較少。本研究對蛇床子素抗人宮頸癌Hela細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示蛇床子素能有效地抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

ROS是一類具有比分子氧更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的含氧物，主要包括離子狀態(tài)的超氧陰離子、羥根離子和非離子狀態(tài)的過氧化氫等。正常生理?xiàng)l件下生物體內(nèi)存在著一套完善的氧化/抗氧化體系，可將ROS維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)。當(dāng)ROS過度產(chǎn)生，超過了機(jī)體抗氧化防御的能力，就會促使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[10-12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種臨床應(yīng)用的抗癌藥物如三氧化二砷、烷化劑、多柔比星、紫杉醇和喜樹堿等，能通過誘導(dǎo)ROS的大量增加來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而達(dá)到抗癌的目的[10,13-14]。Groninger等[15]用長春新堿(vincristine，VCR)作用于初發(fā)急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患兒的骨髓白血病細(xì)胞和ALL細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞。在VCR作用的早期即可在Jurkat細(xì)胞檢測到ROS的存在，應(yīng)用ROS清除劑作用后，ROS的產(chǎn)生被抑制，并且Caspase酶系活性降低，進(jìn)而抑制Jurkat細(xì)胞凋亡。但是，蛇床子素能夠通過誘導(dǎo)ROS的增加來誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，目前尚無研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，蛇床子素誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡與其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、升高ROS水平有關(guān)。

越來越多的研究顯示，Bcl-2蛋白家族成員在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起重要調(diào)控作用。Bcl-2家族包括兩類功能相反的蛋白質(zhì)：抑制凋亡的蛋白(Bcl-2、bcl-xL)和誘導(dǎo)凋亡的蛋白(Bax、Bak、Bid和Bim)[11]。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在凋亡發(fā)生過程中，Bax在某些凋亡相關(guān)因素的激活下，可從胞漿遷移至線粒體膜上，Bax形成線粒體膜通道，導(dǎo)致線粒體膜電位無法維系，膜的完整性遭到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，經(jīng)過Caspase活化級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蛇床子素作用于宮頸癌Hela細(xì)胞后，Bax mRNA的表達(dá)顯著升高，而Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯降低，提示蛇床子素通過誘導(dǎo)Bcl-2/Bax失衡，進(jìn)而促發(fā)凋亡。

綜上所述，蛇床子素通過影響宮頸癌細(xì)胞ROS水平，打破氧化還原平衡，從而改變線粒體膜通透性，促進(jìn)激活促凋亡因子Bax，抑制抗凋亡因子Bcl-2，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Effect of osthole on apoptosis of human cervical carcinoma Hela cells*

YuYoujiang,PengJianming#,YeJilin,SuLandi,LuoXue

(MedicalCollegeofYangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou,Jiangsu225009,China)

Objective To investigate the effect and the possible mechanism of osthole on proliferation and apopotosis of human cervical carcinoma Hela cells and its passible mechanism.Methods After cervical carcinoma Hela cells were incubated with different concentrations osthole，the cell proliferation activity was examined by MTT assay.The apoptosis rate and cellular ROS level were measured by flow cytometry.The Bcl-2 and Bax mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR.Results In comparison with the control group，osthole with different concentrations could obviously inhibit the Hela cells proliferation and accelerated the cellular apoptosis，lowered the expression rate of Bcl-2/Bax，raise the cellular ROS level in a osthole dose-dependent manner.Conclusion Osthole may inhibit Hela cell proliferation and accelerates the cells apoptosis，which might be associated with the increasing the cellular ROS level,promoting Bax expression and inhibiting Bcl-2 expression.

uterine cervical neoplasms;osthole;apoptosis

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.006

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育科研資助項(xiàng)目(NJ201112)。 作者簡介：于有江(1963-)，副教授，本科，主要從事細(xì)胞凋亡、生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。#共同第一作者：彭建明(1984-)，講師，碩士研究生，主要從事醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究。

R34

A

1671-8348(2017)07-0883-03

2016-08-16

2016-11-30)