王晚霞，蔡劍平

（1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/衛(wèi)計委老年醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100730）

胰島素變異的病理效應(yīng)綜述

王晚霞1，2，蔡劍平2*

（1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/衛(wèi)計委老年醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100730）

胰島素及其前體胰島素原功能和結(jié)構(gòu)異常是發(fā)生糖尿病的原因之一。人胰島素基因變異影響胰島素合成的各個環(huán)節(jié)，已經(jīng)被確定為新生兒糖尿病、青少年早發(fā)性糖尿病、自身抗體陰性1型糖尿病和早發(fā)性2型糖尿病的病因。前胰島素原突變可以引起糖尿病、高胰島素血癥和高胰島素原血癥，其機制主要與胰島素原錯誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島B細胞凋亡有關(guān)。

胰島素；糖尿?。换蜃儺?/p>

胰島素及其前體胰島素原功能和結(jié)構(gòu)異常是發(fā)生糖尿病的原因之一。胰島素變異影響其與受體結(jié)合或其高爾基體進一步成熟，導(dǎo)致非高血糖血清胰島素、胰島素原或胰島素原裂解物升高。變異還通過影響胰島素內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成熟，導(dǎo)致胰島B細胞凋亡、減少。近年來，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的胰島素變異位點被發(fā)現(xiàn)，胰島素變異在糖尿病發(fā)病機制中的作用日益受到重視。

1 胰島素基因變異的病理效應(yīng)

1.1 影響胰島素基因轉(zhuǎn)錄和翻譯

胰島B細胞合成胰島素時，胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均受嚴格的調(diào)控，而參與胰島素基因表達的非編碼區(qū)基因突變常會影響胰島素的合成。已發(fā)現(xiàn)影響胰島素基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的12種非編碼區(qū)基因突變?yōu)殡[性遺傳[1-2]，其中5種位于胰島素基因啟動子區(qū)，導(dǎo)致啟動子區(qū)缺失或DNA與調(diào)控蛋白結(jié)合位點丟失，90%的突變都會下調(diào)啟動子的活性[2]。與糖尿病有關(guān)的非編碼區(qū)基因突變有：缺失型（c.-366_-343del，c.-370-_186+del，c. -65_581del）、啟動子區(qū)（c.-331 C＞A/G，c.-332C＞G+c.-331 C＞G，c.-218 A＞C）、3’UTR（c.*59 A＞G）、翻譯起始區(qū)（c.3G＞T，c.3G＞A）和提前終止型[c.184C＞T（Q62X）][2]。

1.2 影響前胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位和移位

前胰島素原包含一個疏水性的N-末端的信號肽，胰島B細胞中，前胰島素原信號肽的斷裂觸發(fā)胰島素原單體的折疊[3]。前胰島素原信號肽N或C末端突變易影響胰島素原合成4個早期事件，即遷移的完成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）信號肽酶催化的信號肽切除、觸發(fā)B鏈折疊和觸發(fā)二硫鍵的形成[4]。目前信號肽部分與糖尿病有關(guān)的胰島素變異有4種，即R6C、R6H、L13R、A24D[5-7]。L13R和A24D變異常導(dǎo)致較為嚴重的新生兒永久性糖尿病，而R6C和R6H變異常表現(xiàn)為病情相對新生兒永久性糖尿病較輕的青少年早發(fā)性糖尿病，表明這些變異誘發(fā)糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機制不同。

1.3 影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊

胰島素原在多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的分子伴侶蛋白作用下進一步折疊，并形成3個二硫鍵。據(jù)預(yù)測，約70%致前胰島素原氨基酸變異的基因突變會影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正常折疊，其中一半以上已經(jīng)在實驗中證實。由于半胱氨酸對二硫鍵的形成至關(guān)重要，變異的氨基酸以有無涉及半胱氨酸的形成可分為兩大類，然而這些變異均通過干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)二硫鍵的形成阻礙胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊。涉及半胱氨酸的變異有C31Y、C43G、F48C、R55C、G84R、R89C、G90C、C95S、S101C、C96Y/S/R、Y103C、Y108C/X、C109F/Y/R，其中C96Y和C95S變異不僅可以見于人MIDY綜合征，也可見于鼠類糖尿病模型，受到研究者廣泛關(guān)注[8]。研究證實，這些變異擾亂了通過改變半胱氨酸或產(chǎn)生新的半胱氨酸干擾正常二硫鍵的形成，阻礙了后續(xù)的折疊步驟。例如體外表達突變體胰島素原C96Y能改變野生型胰島素原在ER中的穩(wěn)態(tài)分布，影響B(tài)細胞功能[9]。與半胱氨酸無關(guān)但同樣會影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊的變異有H29D、L30M/P/ V/Q、G32R/S、L35P、R46Q、L39Y40delinsH、G47V[6，8，10-12]，這些變異阻礙胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)正確形成二硫鍵，往往產(chǎn)生錯配的二硫鍵，擾亂了胰島素原的正常折疊。

1.4 影響胰島素原的轉(zhuǎn)運和成熟

正確折疊的胰島素原將由ER進入高爾基體，兩個內(nèi)切蛋白酶PC1和PC2與外肽酶CPH協(xié)同作用，使胰島素原轉(zhuǎn)換為胰島素。PC1裂解人胰島素原B鏈/C鏈連接處羧基端Arg31和 Arg32，而PC2裂解A鏈/C鏈連接處Lys64和Arg65。CPH的主要作用是移除PC1和PC2作用后殘留的堿性氨基酸，加速轉(zhuǎn)換過程。

目前已發(fā)現(xiàn)的B鏈-C肽和C肽-A鏈交界處的胰島素基因突變有5種。C肽-A鏈交界處的精氨酸可以被亮氨酸、組氨酸或脯氨酸取代，導(dǎo)致高胰島素原血癥、臨界性糖耐量異?；蜻t發(fā)性糖尿病。相反，B鏈-C肽和C肽-A鏈交界處的精氨酸被半胱氨酸取代后則導(dǎo)致早發(fā)胰島素缺乏型重度糖尿病。比較R89L和R89C變異發(fā)現(xiàn)，R89L變異時細胞可以分泌胰島素原，而R89C變異可以導(dǎo)致胰島素原錯誤折疊并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯留?？梢?，這些變異所致的臨床表現(xiàn)因剪接位點取代氨基酸的不同而不同。胰島素原B鏈-C肽交界處R55C突變的患者C肽水平正常，胰島素缺乏嚴重，尚不清楚胰島素嚴重缺乏的原因。將R55C變異型轉(zhuǎn)入MIN6細胞發(fā)現(xiàn)，變異胰島素R55C通常位于分泌顆粒，造成ER應(yīng)激和MIN6細胞減少[6]。

1.5 影響胰島素與受體的結(jié)合能力

影響胰島素和受體結(jié)合的氨基酸很多，主要是A鏈氨基末端和B鏈羧基末端區(qū)域的氨基酸。這些氨基酸的變異會導(dǎo)致胰島素二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，影響胰島素的穩(wěn)定性及胰島素與受體的親和力。

關(guān)于B鏈結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究最多，特別是B鏈的羧基末端。去除HisB5急劇降低胰島素與受體結(jié)合活性，僅保留15%。LeuB6缺失變異將使胰島素與受體的結(jié)合能力不足1%。HisB10對維持胰島素的最大活性非常重要，當其被AspB10替代時，胰島素原將不能轉(zhuǎn)換為胰島素，導(dǎo)致循環(huán)中胰島素原增加。B鏈羧基末端一些進化上比較保守的氨基酸對胰島素與受體的親和力非常重要，包括 GlyB23、PheB24、PheB25和TyrB26，其中PheB24形成的氫鍵對二聚體形成至關(guān)重要。曾有研究發(fā)現(xiàn)，用其他氨基酸取代PheB24后，胰島素活性顯著下降。SerB24胰島素類似物活性約為胰島素活性的7%～15%，LeuB24胰島素類似物活性約為胰島素活性的10%～50%。最近，Zakova等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用L型其他氨基酸替代PheB24，胰島素生物活性和親和力顯著下降，非芳香族氨基酸LeuB24、SerB24和AlaB24胰島素類似物親和力多不超過20%，用甘氨酸取代PheB24，其親和力約為22%～78%?？傊?，胰島素單體這些區(qū)域?qū)ζ渑c受體的結(jié)合非常重要，去除或替代這些區(qū)域氨基酸的胰島素類似物與受體結(jié)合或激活受體的能力下降。

2 胰島素變異與疾病

胰島素基因突變可以引起糖尿病、高胰島素血癥和高胰島素原血癥，其機制主要與胰島素原錯誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島B細胞凋亡有關(guān)。

2.1 糖尿病

早期研究認為，胰島素基因突變引起糖尿病的可能性很小，因為胰島素基因突變較為罕見，不是致病的重要因素。然而，近幾年有研究表明，胰島素基因突變不僅是新生兒永久性糖尿?。≒ermanent Neonatal Diabetes Mellitus，PNDM）的常見原因，也能導(dǎo)致青少年早發(fā)性糖尿病（Maturity-Onset Diabetes of the Young，MODY）。此外，胰島素基因變異是產(chǎn)生Akita和Munich糖尿病鼠的主要原因。

與糖尿病相關(guān)的前胰島素原突變涉及19個氨基酸，包括23種錯義突變、1種無義突變和1種插入缺失突變，它們分布在前胰島素原C肽外所有區(qū)域：信號肽（2個）、B鏈（12個）、A鏈（8個）及C肽側(cè)面成對的堿性氨基酸（2個）。C肽側(cè)面堿性氨基酸位于B鏈-C肽（R55C）和A鏈-C肽（R89C）的酶切位點。到目前為止，其中13種突變出現(xiàn)超過1個先證者；5個密碼子突變（A24D、G32S/R、F48C、R89C和C96Y/S）占所有突變的56%；6個殘基被不同的氨基酸替代：R6C/H、A23S/T、L30M/P/V、G32S/R、C96Y/S和Y108C/X。有5種突變（R6C、R6H、L30M、R46Q和R55C）見于非新生兒期或嬰兒期糖尿病，表明這些變異對胰島B細胞有不同效應(yīng)[14]。

2.2 家族性高胰島素血癥

胰島素變異后產(chǎn)生的效應(yīng)是多樣的，并不是所有的胰島素基因變異都與糖尿病有關(guān)，相反，胰島素有些位點氨基酸變異后僅僅表現(xiàn)為高胰島素血癥，而B鏈10位天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸的胰島素類似物，發(fā)現(xiàn)該胰島素類似物活性超強，與胰島素受體的結(jié)合能力極強。引起高胰島素血癥的變異尚未引起廣泛關(guān)注，其實探索高胰島素血癥的原因同樣有利于闡明2型糖尿病的發(fā)病機制。Banting科學(xué)成就獎獲得者Corkey提出[15-16]，2型糖尿病的先決原因是高胰島素血癥，而胰島素抵抗是其后的代償。

B鏈10位天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸的胰島素變異相繼被發(fā)現(xiàn)。高胰島素血癥（His-B10-Asp）轉(zhuǎn)基因小鼠模型也證實高胰島素血癥的小鼠胰島Langerhans細胞中突變的激素原水平極高，這可能是胰島通過不受調(diào)節(jié)旁路持續(xù)分泌突變酶原的結(jié)果。前胰島素原89位精氨酸是胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素所必需的，研究發(fā)現(xiàn)，這一位點轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸、亮氨酸、脯氨酸后，均表現(xiàn)為高胰島素血癥。

3 結(jié)語

胰島素缺乏和胰島素作用障礙是糖尿病的主要特征，確定引起單基因糖尿病的特定基因變異不僅有利于個體化治療，更有助于我們理解胰島B細胞的生理，為更好地了解糖尿病的發(fā)病機制提供了重要信息。2型糖尿病中胰島素基因變異罕見，其RNA和蛋白質(zhì)水平是否存在這些相似的變異尚不清楚，可進一步從RNA或蛋白質(zhì)水平尋找這些異常胰島素，這有助于闡明糖尿病的發(fā)病機制。

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（*通訊作者：蔡劍平）

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