任雨婷 綜述 黃旭升 審校

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肌萎縮側(cè)索硬化患者腦脊液和血液生物學(xué)標(biāo)志物的研究進(jìn)展

任雨婷 綜述 黃旭升 審校

肌萎縮側(cè)索硬化；腦脊液；生物學(xué)標(biāo)志物；血液；發(fā)病機(jī)制

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種選擇性累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。ALS早期診斷主要依靠臨床癥狀并結(jié)合針極肌電圖檢查，因多數(shù)患者診斷延誤，使其失去早期藥物干預(yù)的時(shí)機(jī)。生物學(xué)標(biāo)志物是近年來隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而提出的一類與細(xì)胞生長增殖有關(guān)的標(biāo)志物。通過探索與疾病相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，可對疾病診斷和療效評估提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)，也可為監(jiān)測疾病進(jìn)展提供客觀參考。發(fā)現(xiàn)ALS生物學(xué)標(biāo)志物對于闡明發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而理解ALS病理生理過程具有重要意義?，F(xiàn)從腦脊液和血液兩方面進(jìn)行綜述。

1 腦脊液檢查

腦脊液與腦組織的細(xì)胞外液及神經(jīng)細(xì)胞直接接觸，與血清、血漿和尿液等其他體液相比，對于反映神經(jīng)元丟失或突觸形成障礙有關(guān)的病理改變具有更高的敏感性。

1.1 神經(jīng)軸突損害相關(guān)標(biāo)志物 (1)神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament, NF)：為成熟神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要成分。部分ALS患者腦脊液中，NF輕鏈和磷酸化NF重鏈含量升高，其中以上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害為主的患者神經(jīng)絲重鏈升高為著，可能是由于上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害引起沿脊髓走行的粗軸索變性, 從而導(dǎo)致大量NF釋放到腦脊液中，腦脊液中NF輕鏈蛋白水平與上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害程度及疾病進(jìn)展速度相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，ALS患者腦脊液中磷酸化NF重鏈較對照組明顯增高，其診斷敏感性和特異性分別為90%和87%，提示磷酸化NF重鏈有望成為診斷疾病和提示預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[2]。(2)tau蛋白：是一種神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白，廣泛分布于神經(jīng)元內(nèi)，在腦內(nèi)主要集中在神經(jīng)細(xì)胞軸突中。有學(xué)者認(rèn)為，腦脊液中tau蛋白在ALS早期增加，后期正常[3]。Grossman等[4]發(fā)現(xiàn)，腦脊液磷酸化tau蛋白(p-tau)與總tau蛋白比率可為ALS診斷提供客觀支持。據(jù)報(bào)道，ALS患者腦脊液中p-tau顯著降低，亦有報(bào)道p-tau無明顯下降[5]。因此，腦脊液中p-tau作為ALS診斷性標(biāo)志物尚有爭議。(3)淀粉樣-β(1-42)：通過形成不溶性斑塊從而引起神經(jīng)變性。ALS患者腦脊液中該蛋白較正常對照濃度低[6]。

1.2 神經(jīng)膠質(zhì)激活或神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)標(biāo)志物 神經(jīng)軸索變性級聯(lián)反應(yīng)早期會出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，相關(guān)標(biāo)志物包括紅細(xì)胞生成素(EPO)、S100β、谷氨酰胺合成酶等[4]。(1)S100β蛋白：是星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞中最豐富的酸性鈣結(jié)合蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞病變的生物學(xué)標(biāo)志物。ALS患者腦脊液中S100β濃度因不同運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病亞型而異，相較于ALS和以上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累為主的患者，以下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累為主的患者S100β水平較低。腦脊液中S100β水平下降提示預(yù)后較好，生存期較長。ALS患者血清中其水平下降[7]。(2)促紅細(xì)胞生成素(EPO)： ALS早期階段腦脊液中EPO含量減低，呼吸肌受累者EPO水平明顯升高，對早期診斷和判斷呼吸肌受累具有提示作用[8]。(3)谷氨酰胺合成酶： ALS患者腦脊液和血清中谷氨酰胺合成酶水平升高，在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中其活性亦，故其臨床指導(dǎo)價(jià)值較小。

1.3 氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物 (1)3-硝基絡(luò)氨酸(3-NT)： ALS患者腦脊液中3-NT水平增高，此改變亦可見于其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[9]，故其應(yīng)用價(jià)值有限；(2)8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)：DNA修飾的標(biāo)志物，可反映氧化應(yīng)激的過程和結(jié)果，ALS患者腦脊液中8-OHdG水平增加，與疾病嚴(yán)重程度或病程無相關(guān)性[10]；(3)SOD1活性：目前關(guān)于ALS患者腦脊液中SOD1活性的報(bào)道結(jié)果不一，因此其臨床指導(dǎo)價(jià)值較小[4]；(4)NO3-：是一種產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，可引起一氧化氮生物轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生游離鐵，研究報(bào)道ALS患者腦脊液中NO3-水平無明顯改變[11]；(5)4-羥基-2,3-壬烯酸(4-HNE)：一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物， ALS患者腦脊液和血清中4-HNE水平明顯升高，并與疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)[12]；(6)氧化蛋白相關(guān)產(chǎn)物： ALS患者腦脊液和血漿中氧化蛋白含量(AOPP，氧化蛋白產(chǎn)物)升高，腦脊液中總抗氧化能力降低，MALDI-TOF質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)鋅-α2-糖蛋白和銅藍(lán)蛋白前體蛋白水平升高，轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶前體和β2微球蛋白3個(gè)蛋白水平下降，但其聯(lián)合診斷作用尚不明確[13]。

1.4 泛素化蛋白相關(guān)標(biāo)志物 反式激活效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白43(TDP-43)是ALS泛素化蛋白包涵體的主要成分，在腦脊液中呈高表達(dá)，具有較高特異性。ALS患者腦脊液中TDP-43水平顯著增高，在疾病起始階段可作為疾病早期標(biāo)志物。研究提示腦脊液中TDP-43水平減低提示TDP-43在皮質(zhì)和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)累積，可能與生存期短有關(guān)[4]。也有報(bào)道稱TDP-43對評估靶向藥物治療效果具有重要作用[14]。

1.5 血腦屏障(blood brain barrier, BBB)/血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier, BSCB)/血腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)功能障礙相關(guān)標(biāo)志物 (1)內(nèi)皮細(xì)胞：內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)受損會影響B(tài)BB/BSCB/BCSFB完整性，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)實(shí)質(zhì)內(nèi)血管滲漏、微出血和含鐵血黃素沉積等，最終導(dǎo)致ALS患者脊髓前角低灌注。ALS患者外周血中內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少[15]，但這一檢測技術(shù)應(yīng)用性不高。(2)金屬蛋白酶(MMPs)：是保持BBB/BSCB/BCSFB功能完整性的酶類，由內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)產(chǎn)生。MMPs通過降解層粘連蛋白、纖連蛋白和Ⅳ型膠原等實(shí)現(xiàn)CNS重塑，并刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和自由基以影響B(tài)BB/BSCB滲透性。多項(xiàng)研究證實(shí)ALS患者和動(dòng)物模型中腦脊液、血清和CNS組織內(nèi)MMP-2、MMP-9水平升高[4]。

1.6 神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物 (1)谷氨酸鹽：ALS患者腦脊液中谷氨酸水平明顯增高，其增高與病程和病情嚴(yán)重程度變化不一致，可能與檢測技術(shù)復(fù)雜有關(guān)。腦脊液中谷氨酸鹽濃度升高可見于約40%ALS患者[4]。(2)5-羥色胺及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸： 5-羥色胺在ALS尸檢患者頸段和胸段脊髓中較正常對照無明顯差別，在腰段脊髓內(nèi)其含量略高于正常對照。5-羥吲哚乙酸在ALS尸檢患者頸段和胸段脊髓中含量降低，腰段脊髓中其含量在正常范圍內(nèi)。腦脊液中是否存在此種改變尚未可知。

1.7 神經(jīng)保護(hù)相關(guān)標(biāo)志物 (1)色素上皮衍生因子(PEDF)：一種視網(wǎng)膜生長因子，可阻止谷氨酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性。ALS患者腦脊液中PEDF水平增高[16]。(2)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)：病程較短ALS患者腦脊液中VEGF降低[17]；亦有報(bào)道ALS患者腦脊液中VEGF升高，并與較長病程和肢體起病有關(guān)[18]。(3)顆粒蛋白前體(PGRN)：一種神經(jīng)營養(yǎng)生長因子，作為CNS損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)志物，具有提高神經(jīng)元存活并促進(jìn)軸突生長的作用[19]。ALS患者腦脊液和血漿中PGRN水平較對照無明顯差別，隨疾病進(jìn)展其腦脊液和血漿含量遞增[20]。(4)胱抑素C(Cys-C)：一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，兼具神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)作用。ALS患者腦脊液中Cys-C水平較對照組明顯減低，臨床疾病進(jìn)展緩慢或無進(jìn)展可引起Cys-C水平增高，病情加重會引起其水平減低；進(jìn)展緩慢患者腦脊液中Cys-C基線水平較低。亦有報(bào)道Cys-C水平較高者生存期較長[21]。

1.8 炎性反應(yīng)和免疫激活相關(guān)標(biāo)志物 (1)細(xì)胞因子/補(bǔ)體/抗體：腦脊液中IL-6、IL-8、C3、C4、過氧硝酸鹽、前列腺素E2、新喋呤、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)抗體水平升高[4]。此外，G-CSF和MCP-1在ALS患者血清中明顯升高[13]。(2)抗神經(jīng)元抗體：部分ALS患者腦脊液中抗GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂、去唾液酸-GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂和硫苷脂等抗神經(jīng)元抗體陽性，提示自身免疫反應(yīng)可能參與啟動(dòng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性過程。(3)殼三糖苷酶(CHIT-1)：由小膠質(zhì)細(xì)胞或浸潤性巨噬細(xì)胞合成的酶類。ALS患者腦脊液中CHIT-1顯著高于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，CHIT-1高表達(dá)提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活的神經(jīng)炎性反應(yīng)[22]。(4)半乳糖凝集素-3：一種半乳糖結(jié)合蛋白，可與細(xì)胞內(nèi)糖蛋白、細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。ALS尸檢患者脊髓內(nèi)半乳糖凝集素-3升高，腦脊液中半乳糖凝集素-3為對照組兩倍之多[23]。

1.9 線粒體功能障礙標(biāo)志物 (1)代謝物：通過核磁共振波譜技術(shù)對ALS患者腦脊液代謝物進(jìn)行捕獲分析，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、乳酸、檸檬酸和乙醇水平升高，提示ALS患者可能處于高異化狀態(tài)，提示線粒體功能障礙參與發(fā)病過程。內(nèi)源性乙醇可作為反映ALS患者神經(jīng)組織損傷的一項(xiàng)新的標(biāo)志物[24]。

1.10 其他生物標(biāo)志物 (1)同型半胱氨酸： ALS患者血漿和腦脊液中同型半胱氨酸較對照組明顯升高，與疾病進(jìn)展、起病年齡和起病部位無相關(guān)性，目前國內(nèi)有類似報(bào)道，其臨床應(yīng)用價(jià)值有待商榷[25]。(2)丙烯醛：ALS患者腦脊液中丙烯醛增高，與病情嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，與疾病進(jìn)展無關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘患者也可見類似表現(xiàn)，故診斷特異性較低[4]。(3)金屬元素：ALS患者腦脊液中鐵、銅、鋅、鎂濃度顯著高于對照組，且以鎂升高最為顯著[26]。(4)胰島素樣生長因子(IGF)及IGF結(jié)合蛋白：IGF結(jié)合蛋白1在ALS患者腦脊液和血清中下降。ALS患者脊髓前角細(xì)胞中, IGF-1水平降低，IGF結(jié)合蛋白-2表達(dá)增加，而腦脊液中未發(fā)現(xiàn)此變化。也有學(xué)者報(bào)道了與之相反的結(jié)果[27]。(5)microRNA：ALS患者腦脊液中microRNA181a-5p上調(diào)，microRNA21-5p和microRNA15b-5p下調(diào)。microRNA181a-5p/microRNA21-5p和microRNA181a-5p/microRNA15b-5p比值用于診斷ALS，其敏感度和特異度可分別達(dá)到90%，85%和87%，91%[28]。(6)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)：ALS患者腦脊液和血清中FGF-2升高，與臨床指標(biāo)無相關(guān)性，其診斷價(jià)值可能有限[29]。(7)ALS患者腦脊液中細(xì)胞色素C、神經(jīng)分泌蛋白生長因子和甲狀腺素運(yùn)載蛋白下調(diào)[30]。(8)Fms樣絡(luò)氨酸激酶受體3(Flt3)：ALS患者腦脊液和血液中Flt3顯著升高，提示血腦屏障破壞，該物質(zhì)彌散進(jìn)入CNS增加[31]。(9)Vgf：一種神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)肽，是嗜鉻粒蛋白家族的一員。ALS患者腦脊液中Vgf水平隨肌力減弱而下降，有望成為反映肌力減退的可靠指標(biāo)[27]。

2 血液學(xué)檢查

(1)肌酐：通過對未行氣管切開的ALS患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清肌酐基線水平低與生存期短具有相關(guān)性，血清肌酐水平與肌萎縮側(cè)索硬化功能評分、用力肺活量和癥狀持續(xù)時(shí)間有顯著相關(guān)性[4]。(2)肌酶：多數(shù)ALS患者血清肌酶明顯升高，可作為預(yù)測ALS生存的有效指標(biāo)，男性患者和肢體起病顯示肌酶高水平，肌酶與肌肉痙攣有相關(guān)性，肌酶水平低預(yù)示生存期較長[32]。(3)嗜伊紅衍化神經(jīng)毒素：ALS患者血清嗜伊紅衍化神經(jīng)毒素明顯高于正常對照[4]。(4)尿酸：ALS患者血清尿酸低于正常對照，男性患者更突出，但亦見于其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其臨床意義有限[33]。(5)可溶性O(shè)X40：是血清腫瘤壞死因子受體之一，可溶性O(shè)X40顯著低于對照組，提示細(xì)胞因子可能參與ALS發(fā)病[34]。(6)多聚糖： ALS患者血清起源N多聚糖中唾液酸多聚糖增高，核心巖藻糖化多糖減低。提示血清多聚糖可作為ALS疾病標(biāo)志物，可能參與了神經(jīng)元損害[35]。(7)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性分子伴侶：ALS患者血液中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性分子伴侶(PDIA1、ERp57等)水平上調(diào)，此改變亦見于SOD1基因突變小鼠單核細(xì)胞中。隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)TDP-43、親環(huán)蛋白A和ERp57與ALS患者病程顯著相關(guān)，其中ERp57最為顯著[36]。(8)脂質(zhì)氫過氧化物(LPO)：ALS患者血清和腦脊液中LPO明顯升高，疾病嚴(yán)重程度相似的吸煙患者較非吸煙患者LPO水平更高[37]。(9)炎性因子：ALS患者血漿中肌酸激酶、鐵蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13升高，IFN-γ降低[38]。(10)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)：參與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病過程，在神經(jīng)系統(tǒng)生存和發(fā)育等方面具有重要作用。ALS患者血漿中TGF-β1升高，提示在ALS發(fā)病中充當(dāng)多功能細(xì)胞因子的作用[39]。(11)載脂蛋白E(ApoE)：ALS患者血漿ApoE較對照組無差異，與疾病進(jìn)展速率和生存時(shí)間相關(guān)，可作為一項(xiàng)預(yù)測生存的危險(xiǎn)因素[40]。

基于目前國內(nèi)外一系列研究探索，多數(shù)生物學(xué)標(biāo)志物在動(dòng)物模型和體外模型呈現(xiàn)較好的應(yīng)用價(jià)值，但其尚不能滿足實(shí)際臨床需要；還有一部分標(biāo)志物雖在人類體液中呈現(xiàn)明顯的改變，并與某些臨床指標(biāo)相關(guān)，但其敏感性和特異性不高；極少數(shù)標(biāo)志物在ALS患者中有較明顯的改變趨勢，并具有可觀的臨床應(yīng)用價(jià)值，其中腦脊液NF水平呈現(xiàn)出較高的研究價(jià)值，并有望成為診斷疾病和提示預(yù)后的重要標(biāo)志物；TDP-43蛋白在ALS患者腦脊液中呈高表達(dá)，具有較高特異性，對評估靶向藥物療效也有重要作用；腦脊液中Vgf有望成為反映肌力減退的可靠指標(biāo)。此外，血清肌酐在評估臨床疾病嚴(yán)重程度方面顯示出高的價(jià)值；血清肌酶可作為預(yù)測ALS生存的有效指標(biāo)，肌酶水平低預(yù)示生存期較長。綜上所述，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和基因代謝產(chǎn)物等新技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，相信ALS生物學(xué)標(biāo)志物的研究將不斷深入和發(fā)展。

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(2016-12-20收稿 2017-01-15修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

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任雨婷，博士研究生，醫(yī)師。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

黃旭升, E-mail：lewish301@sina.com

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