劉偉

北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌和真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

·特約專稿·

我國重要病原性真菌的耐藥性研究現(xiàn)狀

劉偉

北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌和真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

近年來，病原性真菌的耐藥現(xiàn)象越來越多，呈逐年上升趨勢，且所致侵襲性感染已成為目前臨床上患者死亡的重要原因之一。本文就我國在耐藥性真菌的判斷、流行病學、耐藥機制及其防治等方面的研究現(xiàn)狀進行簡單介紹。

病原性真菌；耐藥性；機制

近年來，各類廣譜抗生素、皮質激素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用，器官移植及導管技術的不斷推廣普及，以及艾滋病、糖尿病等疾病的發(fā)病率不斷上升，免疫損傷患者逐漸增多。相應地，各種病原性真菌引起的機會性感染發(fā)生率正急劇上升，假絲酵母(又稱念珠菌)已成為此類患者血液中分離出的最常見病原性真菌[1]；且此類感染的病死率高，如骨髓移植受者中侵襲性曲霉病的死亡率高達70%～90%[2-3]。這種情況，一方面源于機體免疫狀態(tài)嚴重受損，另一方面則與病原性真菌對抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性密切相關。本文簡介我國重要病原性真菌的耐藥性研究現(xiàn)狀，希望對真菌感染的準確診斷和精準治療提供幫助。

1 確定病原性真菌耐藥性的方法

耐藥真菌菌株通過抗真菌藥敏試驗確定，方法包括瓊脂稀釋法、紙片擴散法、E-test法、液基稀釋法等。目前用于確定耐藥菌株的方法是美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI)頒布的用于酵母的M27-A3和用于絲狀真菌的M38-A2方案[4-5]，以及由隸屬于歐洲臨床微生物學與感染性疾病學會的歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)[6]頒布的抗真菌藥敏試驗方案。這些方案在培養(yǎng)基種類和酸堿度、孵育溫度和時間、接種菌量、終點判讀標準和質量控制等方面都做了統(tǒng)一規(guī)定，使得按照這些方案進行的試驗及其結果在不同時間甚至不同實驗室之間具有可重復性和可比性，客觀性強。本實驗室于1994年即開始在國內(nèi)引進CLSI的建議方案、其后的一系列修訂方案及目前的確定方案，通過實施研究課題、舉辦培訓班、撰寫論文等多種形式，向國內(nèi)同行進行介紹和推廣。截至目前，此客觀方案已在我國得到普及和廣泛應用。

譬如CLSI方案規(guī)定，試驗用培養(yǎng)基為RPMI 1640液體培養(yǎng)基，酵母的接種量為(1～5)×103CFU/mL，絲狀真菌為(1～5)×104CFU/mL，孵育溫度為35 ℃，念珠菌和曲霉的孵育時間為48 h，隱球菌為72 h。每次試驗前進行質量控制的菌株為ATCC 22019及ATCC 6258。該方案規(guī)定了根據(jù)氟康唑最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)結果而進行白念珠菌、熱帶念珠菌等菌株敏感性判讀的折點：≤8 μg/mL為敏感，16～32 μg/mL為劑量依賴敏感，≥64 μg/mL為耐藥；也提供了伊曲康唑和伏立康唑對這些菌種的敏感性判讀折點；同時強調指出，對于伊曲康唑的判讀折點只適用于黏膜部位感染念珠菌的判讀，涉及深部感染時必須依靠藥物的血液濃度[4]。近幾年，在深入研究的基礎上，相關專家建議對白念珠菌、熱帶念珠菌及近平滑念珠菌可在孵育24 h后進行結果判讀；還增加了棘白菌素類藥物的標準，如表1所示[5]。這些改進可為臨床更快速地提供參考信息，甚至對治療藥物的選擇具有重要意義。遺憾的是，CLSI方案并未對絲狀真菌藥敏試驗結果給出判讀標準。

表1 CLSI液基稀釋法抗真菌藥敏試驗方案中念珠菌藥敏結果的判讀標準

Tab.1 Interpretive guidelines forinvitrosusceptibility testing ofCandida. spp.

敏感(S)劑量依賴性敏感(SDD)中介(I)耐藥(R)氟康唑≤2μg/mL4μg/mL—≥8μg/mL伊曲康唑≤0.12μg/mL0.25～0.5μg/mL—≥1μg/mL伏立康唑≤0.12μg/mL—0.25～0.5μg/mL≥1μg/mL卡泊芬凈≤0.25μg/mL—0.5μg/mL≥1μg/mL米卡芬凈≤0.25μg/mL—0.5μg/mL≥1μg/mL安尼芬凈≤0.25μg/mL—0.5μg/mL≥1μg/mL

注：近平滑念珠菌的棘白菌素類藥物判讀折點：≤2 μg/mL為敏感；4 μg/mL為中介；≥8 μg/mL為耐藥。

EUCAST方案的基本思路與CLSI方案非常相似，只是其接種密度是CLSI方案的100倍，RPMI液體培養(yǎng)基中葡萄糖含量為2%，是CLSI方案的10倍，孵育時間為24 h；且EUCAST方案較CLSI方案似乎更易檢出耐藥菌株。最近有學者基于EUCAST方案就曲霉對伊曲康唑和伏立康唑敏感性的判讀折點給出建議：<2 μg/mL為敏感、=2 μg/mL為中介、>2 μg/mL為耐藥[6]。該建議非常重要，對在目前病原性曲霉耐藥菌株增多的情況下開展相關耐藥性曲霉菌株的監(jiān)測、耐藥機制研究等有非常及時的指導作用。

2 病原性真菌耐藥性的流行病學研究

自從20世紀90年代北京大學真菌和真菌病研究中心最早開始進行白念珠菌對唑類藥物耐藥性[7]研究以來，病原性真菌耐藥性相關工作逐漸開展，包括對唑類藥物耐藥的臨床菌株監(jiān)測、耐藥機制及生物膜形成的探討等，還有對其他藥物如丙烯胺類藥物耐藥性的研究[8]。這些工作集中在病原性真菌耐藥現(xiàn)象的某一個具體方面，且顯得比較零散。2009年7月由北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科牽頭在全國開展的中國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)啟動，專門監(jiān)測病原性酵母對氟康唑和伏立康唑敏感性的流行病學變遷。2012年的資料顯示[9]，超過94%的白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對藥物敏感，12.2%的光滑念珠菌對氟康唑耐藥，7株熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑交叉耐藥，31.9%的少見念珠菌和13.3%的非白念珠菌對氟康唑和伏立康唑耐藥。2015年的資料顯示[10]，超過97.5%的近平滑念珠菌對唑類藥物敏感，11.6%和9.5%的熱帶念珠菌分別對氟康唑和伏立康唑不敏感，14.3%的光滑念珠菌對氟康唑耐藥，11.6%的光滑念珠菌對氟康唑和伏立康唑交叉耐藥，2.3%的光滑念珠菌對安尼芬凈耐藥，但未檢測到對唑類藥物和棘白菌素類藥物交叉耐藥者。2009年11月—2011年4月，由全國63家醫(yī)院67個重癥監(jiān)護室(intensive care unit，ICU)共同參加的“中國ICU念珠菌菌血癥病原菌的分布和抗真菌藥物敏感性評估”前瞻性研究(China-SCAN)調查了96 060例患者，確診249例念珠菌菌血癥，分離到389株病原性念珠菌；藥物敏感性測定顯示[11]，15/156株白念珠菌對氟康唑耐藥，7/156株白念珠菌對氟康唑呈劑量依賴性敏感，部分對伏立康唑和伊曲康唑交叉耐藥，2株熱帶念珠菌對氟康唑耐藥，2株光滑念珠菌對氟康唑耐藥，48/50株光滑念珠菌對氟康唑不敏感，7/50株光滑念珠菌對卡泊芬凈不敏感。這種情況使得兩性霉素B成為治療此類感染的唯一選擇，已引起“全球抗擊侵襲性真菌感染聯(lián)盟”的關注[12]。該研究還發(fā)現(xiàn)了一些少見或罕見甚至國際上首次出現(xiàn)的念珠菌所致感染，如對兩性霉素B和唑類藥物均耐藥的希木龍念珠菌所致感染。由于侵襲性真菌感染日益增多，抗真菌治療也深入開展，使得病原性真菌的耐藥性呈現(xiàn)上升趨勢。因此，定期了解當?shù)夭≡哉婢幬锩舾行缘牧餍胁W特征，具有重要意義。

由煙曲霉、黃曲霉等病原性曲霉所致的侵襲性曲霉病是僅次于念珠菌感染的又一重要真菌感染性疾病。自1997年由Denning等[13]首先描述了煙曲霉對伊曲康唑的耐藥性之后，病原性曲霉對唑類藥物耐藥性的報道越來越多。我國2005年首先由北京大學真菌和真菌病研究中心從1例肺結核后曲霉球患者的痰液標本中分離到對伊曲康唑耐藥的煙曲霉系列菌株[14]。鑒于耐藥性曲霉所致感染日益增多，本課題組從2008年開始對所有臨床標本進行曲霉鑒定、藥敏測定、菌株收藏和耐藥機制的研究。截至目前，已分離到耐唑類藥物的曲霉20余株，其中包括少見的耐藥性黃曲霉、爪甲曲霉等，還構建了藥物敏感性顯著變化的曲霉突變株4株，系統(tǒng)演化性研究提示了這些曲霉耐藥性的獲得和傳播規(guī)律。最近南京學者調查了我國不同城市中煙曲霉對唑類藥物的耐藥情況[15]，從呼吸道感染標本中分離出4/72株耐伊曲康唑的煙曲霉。解放軍疾病預防控制所的學者[16]在8個城市從2010—2015年的臨床標本中分離出8/317株耐唑類藥物的菌株，在13個城市從2014—2015年自然環(huán)境中分離出2/144株耐唑類藥物的煙曲霉。這些工作反映了我國耐藥性曲霉的分布和分離情況。由于耐藥性曲霉所致疾病已成為全球性健康問題，包括本課題組在內(nèi)的我國學者已加入了全球耐藥性曲霉監(jiān)測協(xié)作組。此外，我國學者基于酵母研究的啟發(fā)，在煙曲霉中證實了協(xié)同調節(jié)麥角固醇合成和唑類藥物敏感性的DAP蛋白家族[17]，并描述了線粒體中一個鈣離子輸送體可能參與鈣離子動態(tài)平衡、應激反應及對唑類藥物的敏感性[18]。

3 病原性真菌耐藥性的機制研究

白念珠菌是最重要的病原性真菌，且唑類藥物是臨床上最常用的抗真菌藥物，因此白念珠菌對氟康唑的耐藥最常見，有關白念珠菌對氟康唑的耐藥機制在國際上也研究得最多、最清楚。目前，已明確的耐藥機制有以下幾方面[19]。①唑類藥物作用靶酶的改變：唑類藥物通過抑制真菌14α-脫甲基酶使麥角固醇合成受阻，導致真菌細胞膜的完整性受損而發(fā)揮抗真菌作用。在白念珠菌中，ERG11基因編碼唑類藥物作用靶酶，其突變和過度表達均可導致白念珠菌對氟康唑耐藥。②藥物外排泵的過度表達：與唑類藥物耐藥有關的外排泵有兩類，一類是依賴ATP進行主動運輸?shù)腁TP結合盒轉運子(ATP binding cassette transporter，ABCT)，包括Cdr1p和Cdr2p；另一類是通過電化學勢能進行被動轉運的主要易化子(major facilitator，MF)超家族成員，包括Mdr1p和Ful1p。這兩類外排泵基因過度表達使細胞內(nèi)積聚的氟康唑減少，最終引起對唑類藥物耐藥。此外，轉錄因子Tacp1和組蛋白去乙?；敢矃⑴c上述外排泵編碼基因的過度表達。③麥角固醇合成途徑下游蛋白失活：主要是ERG3基因突變后不能生成有活性的Δ-5,6去飽和酶，引起有毒性的固醇中間產(chǎn)物在真菌細胞內(nèi)蓄積，最終導致耐藥。④熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)通過鈣調磷酸酶(calcineurin)途徑：研究證實該途徑可引起對唑類藥物和棘白菌素類藥物耐藥并維持。

本實驗室在我國最早開始進行白念珠菌對唑類藥物耐藥機制的研究，證實靶酶基因ERG11突變可導致對唑類藥物的耐藥性[7]；其后我國陸續(xù)有學者證實靶酶基因ERG11的突變和高表達可導致白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等唑類藥物耐藥[20-22]，由轉錄因子TAC突變所致的CDR1、CDR2和PDR17高表達可引起白念珠菌對唑類藥物耐藥[23]。白念珠菌可通過Rta2P參與的鈣調磷酸酶途徑來降低對氟康唑的敏感性[24-26]。還有學者在我國確定白念珠菌染色體R的三體型亦可導致對三唑類藥物耐藥[27]。這些工作豐富了病原性念珠菌對唑類藥物耐藥的機制。

隨著耐唑類藥物的病原性曲霉日益增多，我國學者于2005年在我國首先證實唑類藥物作用靶酶cyp51A基因突變所致的M220和G54氨基酸置換能導致對伏立康唑和伊曲康唑耐藥[14]；其后，我國還分離到cyp51A基因啟動子區(qū)34 bp的串聯(lián)重復序列聯(lián)合編碼區(qū)突變所致L98H氨基酸置換(TR34/L98H基因型)及該基因啟動子區(qū)46 bp的串聯(lián)重復序列聯(lián)合編碼區(qū)突變所致Y121F和T289A氨基酸置換(TR46/Y121F/T289A)的耐唑類藥物的煙曲霉[15-16,28]，這些突變已被國外學者證實是導致耐藥的原因。此外，本課題組在我國首次揭示引起侵襲性曲霉病的耐伏立康唑的黃曲霉中cyp51C基因T778G錯義突變是黃曲霉耐伏立康唑的機制[29]，還確定曲霉生物膜對各種抗真菌藥物的敏感性明顯下降[30]。

4 耐藥性真菌的檢測及其相關感染的防治

耐藥性真菌常導致治療失敗，因此利用先進手段快速檢測耐藥菌株對臨床選擇合理的抗真菌藥物具有重要的指導作用。例如，基于臨床上對唑類藥物耐藥的煙曲霉主要由唑類藥物靶酶基因突變所致，包括我國在內(nèi)的各國學者及時發(fā)展了檢測耐藥性煙曲霉的實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法[31]。

此外，探索殺傷耐藥菌株的有效方法是臨床上戰(zhàn)勝耐藥菌株感染的有效措施。我國學者發(fā)現(xiàn)小檗堿(黃連素)可降低耐藥性念珠菌CDR1基因的過度表達[32]，且黃連素、黃岑素(baicalein)等與氟康唑對耐藥性念珠菌具有協(xié)同抑制作用[33-34]。本課題組確定了格爾德霉素與氟康唑對耐藥性念珠菌具有協(xié)同抑制作用[35-36]，卡泊芬凈與伏立康唑、兩性霉素B對耐藥的曲霉生物膜具有協(xié)同抑制作用[30]，還在國際上首先確定了He/O2(2%)低溫等離子體可殺傷耐藥的病原性真菌及其生物膜[37-38]。

5 結語

近年來病原性真菌耐藥現(xiàn)象越來越多，我國的耐藥情況具有獨特性。我們應重視基礎研究與臨床工作的密切結合，加強臨床各科、各專業(yè)之間的配合與協(xié)作，從而在耐藥性機制、耐藥菌株檢測及逆轉耐藥性方面作出確實有效的成績。

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. LIU Wei, E-mail: liuwei@bjmu.edu.cn

Research progress on resistant pathogenic fungi in China

LIU Wei

DepartmentofDermatologyandVenereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisonDermatoses,PekingUniversity,Beijing100034,China

Antifungal resistance has increased rapidly in recent years. The invasive fungal infections caused by the resistant pathogenic fungi have become one of the important reasons resulting in death of patients. In this review, we briefly described the current status concerning defining criteria, epidemiology, resistant mechanisms and treating strategies for resistant fungi in China.

Pathogenic fungus；Drug resistance；Mechanism

國家自然科學基金(81471925)

劉偉

2016-11-10)