丁文靜，渠巍，文田甜

(貴陽市婦幼保健院檢驗科，貴陽 550003)

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidosis, VVC)是婦科常見的感染性疾病，反復感染極易發(fā)展成為復發(fā)性外陰陰道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)，是臨床研究和治療的重點和難點[1]。VVC及RVVC的主要致病菌為白念珠菌，但是隨著免疫缺陷人群的增多，免疫抑制劑在臨床上的使用頻率增加，常規(guī)抗真菌藥物的廣泛使用等因素使非白念珠菌引起的念珠菌病越來越多，白念珠菌分離率呈明顯下降趨勢。然而，不同念珠菌對抗真菌藥物的敏感性存在差異，研究發(fā)現(xiàn)，非白念珠菌對同種藥物的敏感性明顯低于白念珠菌，光滑念珠菌對兩性霉素B和三唑類抗真菌藥物的耐藥性較高，克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥[2-3]。所以，早期、準確鑒定念珠菌菌種(特別是非白念珠菌)將有利于指導臨床治療。

近年來，分子生物學的飛速發(fā)展為微生物的鑒定工作提供了新的途徑，其中，限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性PCR(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)因其操作簡便，靈敏度和特異性較高等特點，廣泛應用于多種微生物的鑒定。本研究期望應用PCR-RFLP分析法對多個念珠菌菌種進行鑒定，并且以念珠菌ITS區(qū)段測序結果為“金標準”，對科瑪嘉顯色培養(yǎng)法、Vitek 2 YST鑒定卡、PCR-RFLP 3種方法對念珠菌菌種的鑒定效果進行比較分析，進而選擇一種簡單、快速、準確的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集貴陽市婦幼保健院2015年6月—2016年5月VVC相關念珠菌培養(yǎng)陽性菌株100株。白念珠菌ATCC 90028、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258由貴州醫(yī)科大學南校區(qū)臨床醫(yī)學研究中心饋贈，熱帶念珠菌ATCC 13803、光滑念珠菌ATCC 15126購于北京中科質(zhì)檢有限公司。臨床菌株和標準菌株均用石蠟油保存法保存菌種。

1.2主要試劑與儀器 PCR mix、引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4:5′-TCCTCCGC

TTATTGATATGC-3′)、MspⅠ酶、ApaⅠ酶、NcoⅠ酶(貴州宏達爾生物科技有限公司)，沙保羅瓊脂平板(鄭州安圖生物工程公司)，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(法國Chromagar公司)，Vitek 2 YST鑒定卡(法國生物梅里埃公司);Vitek 2 Compact儀(法國生物梅里埃公司),9700 PCR擴增儀(美國ABI公司),電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1PCR擴增 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)法提取DNA，使用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。PCR反應體系為13 μL PCR mix，10 μL ddH2O，1 μL ITS1引物，1 μL ITS4引物，1 μL DNA樣品。擴增條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果提交NCBI的Blast軟件進行比對分析(Nucleotide BLAST)，確定念珠菌菌種。

1.3.2PCR-RFLP技術鑒定念珠菌 PCR方法同1.3.1。用限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ、ApaⅠ與NcoⅠ對篩選出的100株念珠菌及5株標準菌株的PCR擴增產(chǎn)物進行酶切分析。將PCR擴增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ進行酶切，37 ℃反應2 h，同時，對疑似近平滑念珠菌的菌株分別采用ApaⅠ與NcoⅠ進行二次酶切，37 ℃反應2 h。酶切產(chǎn)物于20 g/L瓊脂凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中顯像，比較酶切后的電泳條帶，確定念珠菌菌種。不同念珠菌種的ITS核苷酸序列不同，限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別并附著特定的核苷酸序列，并對特定部位的核苷酸進行酶切，不同菌種就會產(chǎn)生不同大小的酶切片段。

1.3.3科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定念珠菌 采用沙保羅瓊脂培養(yǎng)基對105株念珠菌進行復蘇，傳代培養(yǎng)后挑選單個菌落接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結果。顯色結果判讀標準：生長呈綠色菌落為白念珠菌，藍灰色或鐵藍色菌落為熱帶念珠菌，粉紅色(絨毛狀)菌落為克柔念珠菌，淡紫色菌落為光滑念珠菌，白色為其他念珠菌。

1.3.4Vitek 2 YST鑒定卡鑒定念珠菌 將105株念珠菌復蘇至沙保羅瓊脂平板，傳代培養(yǎng)后，按照Vitek 2 Compact儀(version 7.01)的標準操作規(guī)程,挑取純菌落進行生化鑒定，并記錄鑒定結果。

2 結果

2.1105株念珠菌的測序結果 5株標準菌株測序結果分別為白念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌各1株。100株臨床菌株測序結果為白念珠菌41株，光滑念珠菌18株，克柔念珠菌8株，熱帶念珠菌10株，近平滑念珠菌5株，挪威念珠菌3株，葡萄牙念珠菌6株，釀酒念珠菌2株，Cyberlindnerafabianii5株，Candidaorthopsilosis1株，Candidametapsilosis1株。

2.2PCR-RFLP法鑒定結果

2.2.1MspⅠ酶切結果 PCR-RFLP法中被MspⅠ酶切割為271 bp、240 bp左右的2條條帶的白念珠菌42株(包含標準菌株1株)，被切割為533 bp、317 bp左右的2條條帶的光滑念珠菌19株(包含標準菌株1株)，被切割為316 bp、187 bp左右的2條條帶的熱帶念珠菌11株(包含標準菌株1株)，被切割為250 bp、232 bp左右的2條條帶的克柔念珠菌9株(包含標準菌株1株)，被切割為527 bp、148 bp左右的2條條帶的釀酒念珠菌2株，被切割為230 bp、119 bp左右的2條條帶的葡萄牙念珠菌6株，被切割為227 bp、231 bp左右的2條條帶的挪威念珠菌3株，沒有酶切位點、電泳產(chǎn)生596 bp左右的1條條帶的Cyberlindnerafabianii5株，電泳產(chǎn)生500 bp左右的1條條帶的菌株8株(包含近平滑念珠菌標準菌株1株)。見圖1、圖2。

注：1、2，熱帶念珠菌2株；3、4，挪威念珠菌2株；5，光滑念珠菌1株；6，近平滑念珠菌1株；7，Candidametapsilosis1株；8，DNA marker；9、10，白念珠菌2株；11、12、13，克柔念珠菌3株；14，釀酒念珠菌1株；15，Cyberlindnerafabianii1株；16，空白對照；17，白念珠菌1株；18、19，葡萄牙念珠菌2株；20，Candidaorthopsilosis1株。

圖118株念珠菌PCR產(chǎn)物電泳分析

注：1—18，分別為熱帶念珠菌2株、挪威畢赤念珠菌2株、光滑念珠菌1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株、白念珠菌2株、克柔念珠菌3株、釀酒念珠菌1株、Cyberlindnerafabianii1株、白念珠菌1株、葡萄牙念珠菌2株、Candidaorthopsilosis1株；M，DNA marker。

圖218株念珠菌MspⅠ酶切結果

2.2.2疑似近平滑念珠菌的ApaⅠ、NcoⅠ酶切結果 經(jīng)MspⅠ酶切后產(chǎn)生500 bp左右的菌株進行二次酶切，被ApaⅠ酶、NcoⅠ酶均切割為408、78 bp左右的2條條帶的Candidaorthopsilosis1株，僅被ApaⅠ酶切割為414、89 bp左右的2條條帶的Candidametapsilosis1株；均不被ApaⅠ酶、NcoⅠ酶切的近平滑念珠菌6株(包含標準菌株1株)。見圖3。

2.3顯色培養(yǎng)基、Vitek 2 YST鑒定卡結果及3種方法比較分析

注：1～6，分別為CandidaOrthopsilosis1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株、CandidaOrthopsilosis1株、近平滑念珠菌1株、Candidametapsilosis1株；M，DNA marker。

圖3疑似近平滑念珠菌的ApaⅠ、NcoⅠ酶切結果

2.3.1法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(CHROMagar)鑒定結果 105株念珠菌中，白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌在法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上均顯色正確。鑒定錯誤的7株菌落顯紫色的菌株，經(jīng)PCR擴增結果為5株葡萄牙念珠菌，2株釀酒念珠菌。見表1。

表1 法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(CHROMagar)鑒定結果

2.3.2Vitek 2 YST鑒定卡鑒定結果 105株菌株中，1株白念珠菌與2株熱帶念珠菌Vitek 2 YST鑒定卡鑒定不出，Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis與Candidametapsilosis鑒定錯誤，其余菌株均鑒定正確。鑒定錯誤菌株均進行2次重復試驗，結果一致。見表2。

表2 Vitek 2 YST鑒定卡鑒定結果

2.3.33種方法比較及方法學評價 科瑪嘉顯色培養(yǎng)法對白念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等3種念珠菌鑒定正確率100%，對光滑念珠菌的鑒定正確率為73.1%；Vitek 2 YST鑒定卡可鑒定常見念珠菌且正確率較高，不能鑒定Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis與Candidametapsilosis等非常見念珠菌；PCR-RFLP技術可準確鑒定所有念珠菌菌種。見表3。

表3 3種方法鑒定105株念珠菌的比較分析

3 討論

臨床實驗室主要是通過直接鏡檢、顯色培養(yǎng)基、生化鑒定等方法來鑒定念珠菌菌種，其中，顯色培養(yǎng)基具有操作簡便、快速的優(yōu)點，且試劑材料價格適中，便于臨床使用。研究發(fā)現(xiàn)，光滑念珠菌、白念珠菌在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上也會顯白色，漢遜念珠菌和釀酒念珠菌在顯色培養(yǎng)基上絕大部分呈紫色[4]。顯色培養(yǎng)基對光滑念珠菌的鑒定效果也存在一定的爭議。本研究使用科瑪嘉顯色培養(yǎng)法能準確鑒定白念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等3種念珠菌，對光滑念珠菌的鑒定敏感性高，但特異性較低。但由于本次研究的菌株數(shù)較少，需進一步增加實驗數(shù)據(jù)進行驗證。

Vitek 2 YST鑒定卡可鑒定大部分念珠菌菌種，但操作較為繁瑣且耗時長，對不同培養(yǎng)基上同一菌種的鑒定準確率也存在差異[5]。同時，菌種數(shù)據(jù)庫中沒有的少見念珠菌也不能得到準確的鑒定，且鑒定的前提是保證念珠菌的純度，當遇到形態(tài)相似的混合念珠菌感染時，也可能被錯當成1種念珠菌進行鑒定而導致結果錯誤。本次實驗中，Vitek 2 YST鑒定卡可準確鑒定4種常見念珠菌中的大部分菌株，而1株白念珠菌與2株熱帶念珠菌鑒定不出，其他念珠菌中，Cyberlindnerafabianii被錯誤的鑒定為產(chǎn)脘念珠菌(產(chǎn)脘念珠菌為Vitek鑒定結果，Cyberlindnerafabianii為基因測序結果)，Candidaorthopsilosis與Candidametapsilosis鑒定為近平滑念珠菌，其他念珠菌均鑒定正確，因此，此方法可用作科瑪嘉顯色培養(yǎng)法的補充。但不能準確鑒定Cyberlindnerafabianii、Candidaorthopsilosis和Candidametapsilosis等非常見念珠菌，可能是由于這3種念珠菌比較少見，細菌鑒定庫不完善導致。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，各種分子生物學技術逐步應用于微生物的鑒定[6]。PCR-RFLP具有靈敏度和特異性高、操作簡便等特點，廣泛應用于多種微生物的鑒定。Pakshir等[7]實驗證明念珠菌ITS基因是念珠菌鑒定較傳統(tǒng)方法更準確可靠的材料。Leena等[8]已成功應用PCR-RFLP方法鑒定臨床常見致病性念珠菌。本次實驗中，使用限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ進行酶切，可將大部分念珠菌擴增產(chǎn)物切開，電泳后產(chǎn)生不同大小的特異性條帶，可據(jù)此進行念珠菌的鑒定，其中近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis與Candidametapsilosis沒有MspⅠ的酶切位點，且其基因序列長度相近，無法應用MspⅠ酶切的方法進行鑒定，而應用NcoⅠ酶可將Candidaorthopsilosis與近平滑念珠菌、Candidametapsilosis2種菌鑒別開，ApaⅠ酶可進一步將近平滑念珠菌與Candidametapsilosis鑒別開。PCR-RFLP技術不僅有利于常見念珠菌的鑒定，也有利于Cyberlindnerafabianii等非常見念珠菌的鑒定，為早期準確鑒定臨床念珠感染提供了新的選擇，具有很好的應用前景。