諶海蘭 陳 特 畢小云

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科,重慶 400016)

氨基端前B型鈉尿肽單克隆抗體的制備及其鑒定

諶海蘭 陳 特 畢小云

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科,重慶 400016)

目的 通過經(jīng)典單克隆抗體制備技術制備氨基端前B型鈉尿肽(NT-proBNP)單克隆抗體，將單克隆抗體進行特異性和親和力鑒定，并用于免疫學檢測試劑盒的開發(fā)。方法 用帶His-Trx-標簽蛋白的NT-proBNP免疫Balb/C小鼠制備單克隆抗體。使用PEG1500化學融合法將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。用不帶標簽的NT-proBNP對獲取的雜交瘤細胞進行反復多次克隆篩選，將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株經(jīng)腹腔注射Balb/C小鼠誘導產生腹水，經(jīng)蛋白G親和純化后獲得NT-proBNP單克隆抗體并對其進行親和力和特異性進行鑒定。結果 成功進行細胞融合并獲得4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，抗體分泌亞型為IgG1，可特異性識別NT-proBNP。經(jīng)腹腔體內誘生法和蛋白G親和純化，獲得高質量NT-proBNP單克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測抗體效價在1∶105以上。結論 通過傳統(tǒng)經(jīng)典單克隆抗體制備技術成功制備NT-proBNP單克隆抗體，為NT-proBNP檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎。

氨基端前B型鈉尿肽；單克隆抗體；親和純化；心力衰竭

氨基端前B型鈉尿肽(NT-proBNP)與B型鈉尿肽(BNP)相比，具有半衰期更長、分子量更大、無生物學活性等特性，臨床上將其用于心力衰竭、心肌梗死、急性冠脈綜合征等心血管疾病的早期診斷和鑒別診斷，也用于呼吸困難的鑒別診斷。目前NT-proBNP主要采用進口羅氏公司的化學發(fā)光法檢測，由于其試劑價格昂貴，臨床廣泛應用受到極大的限制，開發(fā)具有自主產權的國內NT-proBNP檢測產品具有很高的經(jīng)濟價值和社會前景。單克隆抗體由于其優(yōu)異的特異性，被廣泛地應用于免疫學檢測當中〔1〕。本實驗前期通過分子克隆技術制備了帶Trx-His標簽的NT-proBNP蛋白，用該蛋白免疫小鼠，并用獲取的高純度無標簽的NT-proBNP〔2〕蛋白篩選雜交瘤細胞制備單克隆抗體，經(jīng)染色體計數(shù)分析，獲得多株可穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞株，通過腹水誘生和親和純化獲得了高質量的單克隆抗體，為NT-proBNP免疫學檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 胎牛血清(Hyclone 公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone 公司)；福氏佐劑、PEG1500(Roche公司)；8-AG、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT，Sigma公司)；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Santa Cruz公司)；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Sigma Aldrich 公司)；1 kD透析袋(生工生物)；HRP標記的鏈霉親和素(博士德公司)；恒溫CO2孵箱(Thermo scientific 公司)；水平離心機(Thermo scentific 公司 )；普通光學顯微鏡、電子顯微鏡(Olympus 公司)；蛋白G親和純化柱、蛋白純化儀(KTA purifier)(GE公司)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)，酶標儀(SUNRISE公司)。

1.2 實驗動物和細胞 Balb/C 雌性小鼠，SPF級別，6周齡(免疫)和4周齡(制備飼養(yǎng)細胞)，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心并于動物中心處代養(yǎng)。SP2/0小鼠骨髓瘤細胞購自上海生命科學研究所，由實驗室傳代培養(yǎng)并經(jīng)返祖試驗篩選獲得。

1.3 方法

1.3.1 NT-proBNP免疫小鼠 Balb/C雌性小鼠于免疫前采尾血測本底效價，選取無本底效價的小鼠進行免疫。首次免疫：pet32a(+)-NT-proBNP重組帶標簽的蛋白按150 μg/只免疫，蛋白與等體積完全福氏佐劑混合后，于4℃磁珠攪拌乳化至油包水樣，于SPF實驗室中皮下多點免疫注射小鼠背部、腋窩、四肢、腹股溝。首次免疫后2 w進行第二次免疫，劑量為100 μg/只，蛋白與不完全福氏佐劑乳化后于小鼠背部、腋窩、四肢、腹股溝，多點免疫。二次免疫后2 w進行第三次免疫，方法、劑量同第二次。第三次免疫7 d后采小鼠尾血測效價。選取效價在106以上小鼠取脾融合。于融合前3 d對小鼠進行沖擊免疫：選擇尾靜脈注射，100 μg/只。

1.3.2 SP2/0骨髓瘤細胞和飼養(yǎng)細胞的制備 SP2/0骨髓瘤細胞于融合前兩周用8-氮鳥嘌呤飼養(yǎng)3～7 d，觀察是否有返祖現(xiàn)象。融合后的雜交瘤細胞生長所需生長因子，選擇同品系2～4周齡Balb/C小鼠腹腔巨噬細胞提供。每只Balb/C 小鼠可鋪制2～4塊96孔板。方法：Balb/C 小鼠處死后，于75%酒精浸泡10 min徹底消毒，用大頭釘固定于解剖板，10 ml注射器吸取5～10 ml RPMI1640，緩慢注入小鼠腹腔，反復緩慢抽打幾次后吸出，注入10 ml離心管中，用RPMI1640，1 000 r/min，10 min洗滌2次，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸后細胞計數(shù)，調整細胞濃度4×105/ml，巴氏吸管滴加入96孔培養(yǎng)板中，每孔150 μl。

1.3.3 SP2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的融合 收集SP2/0骨髓瘤細胞，用RPMI1640，1 000 r/min，5 min洗滌兩次。將沖擊免疫過的小鼠從SPF動物實驗中心取出，取眼眶血離心分離血清作為以后篩選融合細胞的陽性對照。將含1×108個脾細胞的細胞懸液和2×107個骨髓瘤細胞的細胞懸液(細胞數(shù)之比為5∶1)移至50 ml離心管中，補加不含血清RPMI1640培養(yǎng)基30 ml，1 200 r/min，10 min，棄上清，吸棄殘留液體，以免影響PEG1500濃度。食指輕彈離心管底使細胞沉淀松散。將離心管浸在預溫至37℃水的燒杯中，用1 ml刻度吸管吸取1 ml預溫至37℃的50% PEG1500溶液，在1 min之內沿離心管壁慢慢加入，邊加邊輕輕攪拌均勻，37℃水浴中作用30 s。1 min內加入1 ml 37℃預溫的RPIM1640不完全培養(yǎng)基終止PEG1500作用，在3 min內加入3 ml不含血清的RPIM1640不完全培養(yǎng)基，10 min內緩慢加入10 ml RPIM1640不完全培養(yǎng)基。最后補加RPIM1640不完全培養(yǎng)基至30 ml，以水平離心機960 r/min，5 min離心，棄上清，加入HAT完全培養(yǎng)基重懸雜交瘤細胞。將融合雜交瘤細胞接種至10塊已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，50 μl/孔，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)〔3〕。

1.3.4 雜交瘤細胞的篩選、克隆和亞克隆 融合后第3天開始可以觀察細胞狀態(tài)，以后隔日觀察一次，到第5天可半量換液，以后每3～5 d用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液。2 w后開始用HT選擇培養(yǎng)基半量換液，4 w后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。當雜交瘤細胞鋪滿96孔板的1/3時，用不帶標簽的NT-proBNP包被96孔酶標板，ELISA篩選獲得陽性融合雜交瘤細胞株并進行克隆。當96孔板中單克隆細胞長至孔底1/3時繼續(xù)進行ELISA篩選并進行陽性細胞株亞克隆，反復篩選得到持續(xù)分泌抗體的雜交瘤細胞株。將持續(xù)分泌抗體的細胞株存入液氮，以后每3個月進行復蘇-凍存循環(huán)，檢測抗體分泌情況，反復3次，最終確定穩(wěn)定分泌抗體的細胞株。

1.3.5 雜交瘤細胞染色體計數(shù) 陽性克隆雜交瘤細胞，采用染色體計數(shù)可確定融合是否成功〔4〕。Balb/C 小鼠有40條染色體，SP2/0骨髓瘤細胞有62～68條，融合成功的雜交瘤細胞有染色體共102～108條。

1.3.6 雜交瘤細胞誘生小鼠腹水 選取2～3個月齡同品系Balb/C雌性小鼠制備腹水。注射細胞前7 d采用不完全福氏佐劑300 μl/只腹腔注射，以激發(fā)小鼠處于反應狀態(tài)。調整8E8雜交瘤細胞濃度至1×106/ml，500 μl/只進行注射。注射后7 d左右開始產生腹水，用5 ml注射器針頭收集腹水。腹水離心：3 000 r/min，10 min，留取上清，棄去沉淀和脂質成分，離心2次，-20℃保存。

1.3.7 單克隆抗體的純化 4℃解凍8E8細胞株腹水，0.22 μm濾膜過濾，用無菌PBS將腹水稀釋5～10倍，蛋白G親和純化柱用PBS平衡至基線后，以1 ml/min緩慢上樣稀釋后的腹水，單克隆抗體特異性結合于親和純化柱上，上樣完后以PBS平衡親和純化柱至基線，再用pH2.7的100 mmol/L甘氨酸洗脫結合于親和柱上的抗體，在收集到的抗體洗脫液中加入適量pH9.0的1 mol/L Tris平衡液體，以防止抗體蛋白沉淀，用分子量5 000的超濾膜濃縮洗脫抗體后用Bradford測抗體濃度，分裝后-20℃保存。

1.3.8 單克隆抗體效價測定及亞型鑒定 ELISA反應板中包被無標簽的NT-proBNP，加入純化后的單克隆抗體共同孵育，洗滌后再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，二抗IgG亞型分別有IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG3，鑒定單克隆抗體的亞型。將純化并濃縮后得到的抗體用PBS倍比稀釋測定抗體效價。

1.3.9 單克隆抗體的Western印跡鑒定 將純化后的8E8單克隆抗體用Western印跡檢測抗體特異性，分別與pet32a(+)Trx-His蛋白、pet32a(+)-NT-proBNP、NT-proBNP反應，結果顯示：純化后的8E8單克隆抗體與Trx-His標簽蛋白不結合，與pet32a(+)NT-proBNP和NT-proBNP均為陽性反應，證明8E8單克隆抗體具有較好的特異性。

1.3.10 單克隆抗體的方法學驗證 將蛋白G親和純化后的8E8 NT-proBNP單克隆抗體用生物素進行標記，用NT-proBNP多克隆抗體包被96孔酶標板，進行雙抗體夾心反應，以HRP標記的鏈霉親和素進行顯色，對免疫學檢測方法的建立進行初步摸索，尋找最適多抗包被濃度和最優(yōu)單抗反應濃度。同時尋找其他影響雙抗夾心反應的最適反應條件。多克隆抗體使用前用PBS充分透析，分裝后-40℃保存。單克隆抗體生物素標記前應將純化后的單克隆抗體用pH9.5的碳酸鹽透析液充分透析以去除純化過程中帶入的Tris和甘氨酸等物質，生物素標記單抗的方法詳見Sigma Aldrich (H1759)說明書。標記后的生物素化單克隆抗體需用1 kD孔徑的生物透析袋4℃對PBS磁珠攪拌透析，每3～4 h換一次透析液，直至將游離的生物素完全透析除去為止，以Bradford測標記后的抗體-生物素蛋白濃度，分裝后-40℃保存。

2 結 果

2.1 免疫小鼠效價測定 Balb/C小鼠免疫前經(jīng)ELISA檢測未檢測到本底效價，經(jīng)三次皮下免疫及一次尾靜脈加強免疫后做細胞融合，融合時取眼眶血測效價，兩只小鼠融合時抗體效價分別為1號：4.8×106，2號：2.4×106，均達到細胞融合要求。

圖1 雜交瘤細胞染色體計數(shù)(×40)

2.2 雜交瘤細胞染色體計數(shù) 融合成功的細胞經(jīng)純蛋白篩選后獲得4株穩(wěn)定分泌抗體的細胞株分別為：1F7、1B11、5E5和8E8。取亞克隆三次的單克隆細胞株染色體計數(shù)，在油鏡下觀察1F7、1B11、5E5和8E8并計數(shù)(圖1)，可見四株細胞染色體計數(shù)都在100條以上(骨髓瘤細胞染色體為62～68條，Balb/C小鼠脾細胞染色體為40條)，證明細胞融合成功。

2.3 雜交瘤細胞抗體亞型鑒定 反復克隆多次的雜交瘤細胞株經(jīng)ELISA鑒定抗體亞型，450 nm測吸光度，可見四株細胞亞型均為IgG1，見表1，證明細胞已達到較好的單克隆狀態(tài)，成功獲得NT-proBNP單克隆細胞株。

表1 單克隆抗體亞型鑒定

2.4 單克隆抗體的純化 將8E8單克隆細胞株雜交瘤細胞腹腔注射Balb/C小鼠，獲取的腹水經(jīng)蛋白G親和純化法純化單克隆抗體，在GE AKTA Purifier，UV 280 nm監(jiān)測下可見一個明顯的單克隆抗體蛋白峰，見圖2。獲得的單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE鑒定，可見κ鏈位于55 kD，λ鏈位于25 kD處，純度可達95%以上，見圖3。

A：穿透峰；B：單克隆抗體洗脫峰圖2 單克隆抗體親和純化圖

圖3 單克隆抗體SDS-PAGE鑒定

2.5 免疫印跡鑒定單克隆抗體特異性 經(jīng)蛋白G親和純化后的8E8單克隆抗體以1∶100稀釋用于單克隆抗體的特異性鑒定，可見，8E8單克隆抗體與pet32a(+)NT-proBNP和NT-proBNP蛋白有特異性反應，與pet32a(+)Trx-His標簽蛋白無反應，表明單克隆抗體具有較好的特異性，見圖4。經(jīng)ELISA檢測親和純化后的單克隆抗體親和力，效價在1∶105以上。

2.6 單克隆抗體的方法學驗證 建立免疫學檢測方法，首先對封閉液的封閉效果進行了優(yōu)化，分別采用了2%BSA，5%BSA，10%BSA，2.5%BSA+100 μg/ml salmon DNA，5%BSA+100 μg/ml salmon DNA，結果顯示在2.5%BSA+100 μg/ml salmon DNA時封閉效果最好，背景本底最低。

多克隆抗體以不同濃度梯度(10、5.0、2.5、1.25、1.0、0.625 μg/ml)以磷酸鹽緩沖液100 μl/孔，在4℃包被過夜，以不同濃度的生物素標記的8E8單克隆抗體濃度(10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 μg/ml)，以棋盤法尋找最優(yōu)生物素標記單克隆抗體與多克隆抗體的反應濃度，由表2可見，最適多克隆抗體包被濃度為1.25 μg/ml，最適生物素標記單克隆抗體濃度為0.312 5 μg/ml。通過不同濃度的HRP標記的親和素，以及不同濃度的TMB顯色劑，也是通過棋盤法來尋找最優(yōu)的反應濃度，結果顯示在設定顯色反應時間為25 min時：在親和素-HRP稀釋濃度為1∶8 000，TMB使用濃度為1∶400時，二者反應比例最好，顯色最深。

1:NT-proBNP；2:pet32a(+)NT-proBNP；3:pet32a(+) 標簽蛋白；M：Marker圖4 單克隆抗體免疫印跡鑒定抗體特異性表2 多克隆抗體濃度和生物素標記單克隆抗體 濃度的優(yōu)化(μg/ml)

包被多克隆抗體(μg/ml)52.51.250.6250.31250.16551.7621.8371.7291.391.1681.2812.51.9362.141.9861.8641.8961.8361.252.0361.982.0511.8442.1511.8341.02.0661.9461.9851.8781.891.8320.50.4660.6010.3880.2320.1770.179

3 討 論

本研究前期構建了質粒pet32a(+)NT-proBNP，獲得了帶Trx-His標簽的NT-proBNP，由于NT-proBNP分子量小，為提高其免疫原性，本實驗用帶Trx-His標簽的NT-proBNP蛋白作為免疫原免疫小鼠，為了排除針對標簽抗體的單克隆抗體，篩選時用無標簽NT-proBNP篩選單克隆細胞株。本研究通過經(jīng)典雜交瘤技術獲得了NT-proBNP雜交瘤細胞并對其進行了亞型分析，通過腹水誘生法制備了NT-proBNP單克隆抗體，使用蛋白柱親和層析純化的方法得到了高純度的單克隆抗體，鑒定了單克隆抗體的特異性。一株好的單克隆抗體不僅需要具有高的特異性還要求具有高的親和力，本研究獲得的單克隆抗體效價在105左右，可以滿足科研檢測的需要，需要獲得更高效價的單克隆抗體，可以通過低溫超濾濃縮，或通過提高抗體純化技術得到更高效價的單克隆抗體。本研究成功獲得NT-proBNP的優(yōu)質抗原、高質量多克隆抗體和優(yōu)質單克隆抗體，通過初步試驗證明該抗原、多克隆抗體、單克隆抗體可以有效結合反應，為下一步研發(fā)NT-proBNP的免疫學檢測試劑盒奠定了基礎。NT-proBNP作為公認有效的診斷心力衰竭，以及鑒別診斷心衰的指標，應用越來越受到推崇，但是，目前NT-proBNP電化學發(fā)光檢測試劑盒仍然需要從國外進口，價格非常昂貴〔5～9〕。國內市場開發(fā)出了一些試劑盒，但其檢測方法多為金標法，其靈敏度還較低，不能滿足臨床醫(yī)生對診斷的需求。NT-proBNP的電化學發(fā)光檢測最核心的技術是其單克隆抗體的獲得，其效價、純度的優(yōu)劣直接關系到產品的質量，國內市場要在這方面取得突破，還需加大研發(fā)力度以獲得高質量的單抗。

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〔2015-08-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Preparation and identification of monoclonal antibody against NT-proBNP

CHEN Hai-Lan, CHEN Te, BI Xiao-Yun.

Department of Laboratory, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Objective To make monoclonal antibody of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) with traditional chemical fusion and cloning screens technique, identify the specificity and affinity, provide a foothold for constructing immunological test kit with this acquired antibodies for NT-proBNP.Methods Chemical fusion technique was used to get hybridoma of NT-proBNP. Hybridomas were identified with chromosome dyeing counting. Monoclonal antibodies of NT-proBNP were acquired by peritoneal injection hybridomas in Balb/C mouses. Monoclonal antibodies of 8E8 were purified by protein G affinity purification in GE AKTA Purifier. SDS-PAGE identified the purity quotient of it. The affinity was identified with ELISA, and Western blot was used to identify the specificity of this antibodies.Results Chromosome dyeing counting proved that hybridomas were prepared successfully. Four hybridomas (1F7,1B11,5E5 and 8E8)steadily secreting NT-proBNP monoclonal antibody were screened out. The isotype of all the four hybridomas was IgG1. The titer of the 8E8 monoclonal antibody after purified with protein G affinity was above 105 with a good purity quotient up to 95%. Western blot showed that this antibody had a good conjugation with NT-proBNP.Conclusions The hybridomas persistent secreting monoclonal antibody against NT-proBNP are successfully prepared. This would be an outstanding experimental basis for NT-proBNP immunological kit construction.

NT-proBNP；Monoclonal antibody；Affinity purification；Heart failure

國家自然科學基金項目(31270984)

諶海蘭(1984-)，女，碩士，檢驗技師，主要從事病原微生物學致病機制及體外診斷試劑研發(fā)研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)03-0525-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.002