孫永慧+趙靜+孫楠

[摘要]目的 建立健腰通顆粒中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。方法 以高效液相色譜法測(cè)定健腰通顆粒中黃芪甲苷的含量，采用Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min；柱溫：40℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)中氮?dú)饬髁浚?.5 L/min；漂移管溫度：105℃。結(jié)果 黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.56～4.20 μg（r=0.9994）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收率為95.83%（RSD為1.39%，n=5）。結(jié)論 本含量測(cè)定法重復(fù)性和精密度良好，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，可作為該制劑質(zhì)量的檢測(cè)方法。

[關(guān)鍵詞]健腰通顆粒；黃芪甲苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（c）-0140-03

[Abstract]Objective To establish the method for the determination of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules.Methods HPLC was used the quality of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules，analytical column was Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）.Mobile phase was Acetonitrile-Water（30∶70）.Flow rate was 1.0 ml/min，the parameter of ELSD detector：the flow rate of N2 was 2.5 L/min；the temperature of drift tube was 105℃.Results The linear range of astragaloside Ⅳ was from 0.56 to 4.20 μg（r=0.9994）.The average recovery was 95.83%（RSD=1.39%，n=5）.Conclusion This method is proved to be sensitive and reliable.It can be the quality detection method of Jianyaotong Granules.

[Key words]Jianyaotong Granules；Astragaloside Ⅳ；HPLC；Content determination

健腰通顆粒是由黃芪、雞血藤、骨碎補(bǔ)、桑寄生、牛蒡子、補(bǔ)骨脂、三七、淫羊霍、水蛭、鹿茸等多種中藥組成的復(fù)方制劑。具有疏筋養(yǎng)血，補(bǔ)腎益氣，強(qiáng)腰健腎的功效。用于腰間盤(pán)突出，腰椎增生及頸腰綜合癥，具有良好的治療效果。黃芪是該制劑中起主要作用的藥物，本實(shí)驗(yàn)以高效液相色譜（HPLC）法對(duì)健腰通顆粒中黃芪甲苷進(jìn)行了含量測(cè)定[1-14]，以控制該制劑的質(zhì)量。

1儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀（Waters公司，Empower工作站）；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Alltech 2000型，奧泰克公司）；BP221S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；健腰通顆粒（批號(hào)：20150301，20150302，2015 0303），由黑河市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)；黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201209）， 從中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)得。甲醇（色譜純，迪馬公司）；D101型大孔吸附樹(shù)脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20140510）；三氯甲烷（天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150915）；正丁醇（天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20151020）；氨水（天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20151201）；無(wú)水乙醇（天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20151208）；甲醇（天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150815）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱型號(hào)：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70）；流速為1.0 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)中氮?dú)饬髁浚?.5 L/min；漂移管溫度：105℃；柱溫是40℃。此分離檢測(cè)條件下，供試品中黃芪甲苷色譜峰與其它色譜峰分離度良好，基線平穩(wěn)，陰性制劑無(wú)干擾，HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2供試品溶液的制備

取健腰通顆粒（批號(hào)：20150301）3袋，粉碎，取粉末25 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流2 h。棄去三氯甲烷提取液，濾紙筒揮干三氯甲烷，再加甲醇適量，加熱回流4 h。甲醇提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 ml，稍微水浴加熱攪拌使溶解，室溫放冷，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，40 ml/次。正丁醇提取液合并，用氨試液振搖洗滌2次，40 ml/次，棄去氨試液，正丁醇提取液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解。水液通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，裝入樹(shù)脂高12 cm），用水50 ml洗脫，棄去水洗脫液，再用40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，得健腰通顆粒待測(cè)供試品溶液。

2.3黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備

取黃芪甲苷對(duì)照品約3 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，加色譜甲醇至刻度，振搖使溶解混勻，得每1 ml含0.28 mg的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

2.4線性關(guān)系的考察

取黃芪甲苷對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2、5、8、10、12、15 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量微克數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以黃芪甲苷色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=1.6418 X+10.9741（r=0.9996），提示黃芪甲苷對(duì)照品的進(jìn)樣量在0.56～4.20 μg有良好的線性關(guān)系，可以用外標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行含量測(cè)定。

2.5精密度試驗(yàn)

取黃芪甲苷對(duì)照品溶液，吸取5 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芪甲苷對(duì)照品色譜峰面積的RSD值為1.97%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取健腰通顆粒供試品溶液，在7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測(cè)定，分別是：0、2、4、6、8、10、12 h，每次精密進(jìn)樣20 μl，結(jié)果健腰通顆粒的供試品溶液在12 h之內(nèi)測(cè)定，黃芪甲苷峰面積數(shù)值是穩(wěn)定的，RSD=2.56%。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批健腰通顆粒，粉碎后稱取6份，每份約25 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法提取制備供試品溶液。分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液5 μl、10 μl以及供試品溶液20 μl，按照前述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算供試品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果測(cè)得黃芪甲苷含量分別為0.0328、0.0336、0.0351、0.0343、0.0358、0.0353 mg/g，平均值為0.0345 mg/g（RSD=3.24%），結(jié)果顯示本藥含量測(cè)定方法有較好的重復(fù)性。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取同一批健腰通顆粒供試品，粉碎，分別取細(xì)粉6份，每份約12.5 g，精密稱定重量，在每份供試品細(xì)粉中分別加入黃芪甲苷對(duì)照品0.42 mg（精密吸取濃度為0.28 mg/ml的黃芪甲苷對(duì)照品溶液1.5 ml），按照前述“2.2”供試品溶液制備項(xiàng)下的方法進(jìn)行提取以及進(jìn)行含量測(cè)定見(jiàn)表1。

五份健腰通顆粒供試品的平均加樣回收率為94.79%（RSD=1.46%）。結(jié)果顯示該藥回收率較高，測(cè)定方法可靠。

2.9供試品測(cè)定

取三批健腰通顆粒（批號(hào)：20140901，20140902， 20140903）各3份，粉碎，每份取約25 g，精密稱定重量，按照前面2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，得到待測(cè)黃芪甲苷含量的健腰通顆粒供試品溶液。分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液5、10 μl以及供試品溶液20 μl，按照前述方法進(jìn)樣、測(cè)定、計(jì)算供試品中黃芪甲苷的含量，見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，三批健腰通顆粒中黃芪甲苷含量平均為0.0373 mg/g，按平均值80%制訂健腰通顆粒中黃芪甲苷含量[15]，每克健腰通顆粒中黃芪甲苷含量應(yīng)≥0.03 mg。

3討論

本方中黃芪起主要作用，其主要成分為黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷等，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定該藥中黃芪甲苷的含量來(lái)控制該制劑的質(zhì)量。含量測(cè)定參考《中國(guó)藥典》2015年版一部“黃芪”藥材[含量測(cè)定]項(xiàng)下的方法[1]，并參考文獻(xiàn)[2-14]，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)實(shí)際色譜分離效果調(diào)整流動(dòng)相乙腈-水的比例，在乙腈-水（30∶70）時(shí)黃芪甲苷色譜峰分離度良好，保留時(shí)間適宜，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，是該制劑黃芪甲苷含量測(cè)定最優(yōu)的色譜條件。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器用于測(cè)定黃芪甲苷的含量，重復(fù)性、靈敏度、穩(wěn)定性均能符合含量測(cè)定的要求。本試驗(yàn)對(duì)漂移管溫度、霧化器溫度、流動(dòng)相流速以及載氣流速等試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了研究試驗(yàn)、優(yōu)化調(diào)整。本試驗(yàn)的最終優(yōu)化條件：流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70），流速為1.0 ml/min，柱溫為40℃，蒸發(fā)光蒸發(fā)溫度為105℃，載氣（氮?dú)猓┝魉贋?.5 L/min。

綜上所述，本黃芪甲苷含量測(cè)定方法快速、靈敏、簡(jiǎn)便，精密度、線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及加樣回收率均符合要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于健腰通顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2016-08-29 本文編輯：顧雪菲）