牛 睿 林 燕 王 鵬 伊淑瑩

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

過敏性哮喘中肺部樹突狀細胞體內(nèi)趨化實驗研究*

牛 睿 林 燕 王 鵬 伊淑瑩

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

目的 研究過敏性哮喘中DC與CD4+T淋巴細胞的相互作用，探討過敏性哮喘中DC在體內(nèi)是否可以直接趨化CD4+T細胞，從而為哮喘治療提供新的方向。方法 分選C57BL/6哮喘模型小鼠肺部DC注射到小鼠后背氣泡中，細胞注射12 h后，流式細胞儀檢測氣泡內(nèi)CD4+T淋巴細胞數(shù)目。結(jié)果 與僅注射PBS的對照相比，注射DC組趨化至氣泡內(nèi)的CD4+T細胞顯著上升。結(jié)論 本研究表明過敏性哮喘中DC在體內(nèi)可以直接趨化CD4+T細胞。

過敏性哮喘；樹突狀細胞；CD4+T淋巴細胞

過敏性哮喘是哮喘的最主要形式，是一種以氣流阻塞、黏液高分泌和淋巴細胞、嗜酸粒細胞及肥大細胞浸潤氣道壁為特征的常見慢性呼吸道疾病。流行病學(xué)研究表明,全球約有3億成年哮喘患者，發(fā)病率高達18%左右，其中約80%為過敏性哮喘[1]。經(jīng)典免疫學(xué)說認為哮喘的發(fā)病機制與輔助性T細胞亞群即Thl/Th2功能失衡密切相關(guān)。樹突狀細胞(DC)作為功能最強的專職抗原提呈細胞處于機體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC構(gòu)成性表達MHC II類分子和共刺激分子如CD80、CD86等，具有在外周局部組織攝取抗原后，遷移到相應(yīng)淋巴器官并刺激初始T細胞活化和增殖的獨特功能；DC分布廣泛，通過表達一系列能夠識別“危險信號”的“模式識別受體”，收集局部微環(huán)境中的各種危險信號，并傳遞給T淋巴細胞，從而啟動獲得性免疫反應(yīng)，因此DC是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁[2]。本研究提供了研究細胞體內(nèi)趨化作用的方法，并研究了過敏性哮喘中DC與CD4+T細胞的直接作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 常規(guī)小鼠雌性C57BL/6(H-2Kb)近交系小鼠，7～8周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要用品與試劑 雞卵清蛋白(Albumin from chicken egg white)購自Sigma公司出產(chǎn)，免疫佐劑明礬(Al(OH)3，alum)購自Thermo Scientific Imject TM；1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)購自Thermo公司。流式抗體percy-cy 5.5-CD11c、e450-ly6c、A780-CD11b購自eBioscience和PE-cy7-IA/IE購自Biolegend，PE-Siglec F購自BD Bioscience。用BD FACS Aria II分選型流式細胞儀進行細胞分選。

1.3 實驗方法 (1)小鼠麻醉并剃毛：1%苯巴比妥鈉100 μl腹腔注射，麻醉正常C57BL/6小鼠，待小鼠麻醉后剔除背部毛發(fā)。(2)背部皮下制備氣泡：用5 ml注射器皮下注入3 ml氣體，在小鼠背部形成氣泡，3天之后要再注射1次，保證氣泡內(nèi)充氣為3 ml。兩次注射空氣后的氣泡小鼠如圖1所示。(3)FACS分選DC并注射入氣泡： 按照文獻報道的實驗方法[4]，誘導(dǎo)過敏性哮喘小鼠模型。以免疫佐劑明礬(alum)加入六型 OVA (20 μg)，震蕩混勻充分乳化OVA后， d-28給予小鼠腹腔注射做初次致敏，d-14再次相同劑量進行第二次腹腔致敏，然后在0～2天之間用1%OVA (五型OVA)連續(xù)霧化3天，每次20 min，構(gòu)建小鼠過敏性哮喘模型。制備C57BL/6哮喘模型小鼠肺部單細胞，流式抗體標記后分選肺部DC，將分選出的肺部 DC 細胞5萬個注射入小鼠背部氣泡內(nèi)。(4)檢測氣泡中趨化的細胞數(shù)量：細胞注射12 h后，用PBS沖洗氣泡并收集沖洗液，流式抗體染色，流式細胞儀檢測。

圖1 氣泡小鼠

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用 SPSS20.0對所得數(shù)據(jù)進行方差分析和χ2檢測，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺部DC分選策略 制備哮喘小鼠肺單細胞并用多色熒光抗體標記后，去除粘連細胞及死細胞, 然后用SiglecF與CD11c去除嗜酸性粒細胞及肺泡巨噬細胞，進一步用CD11b及l(fā)y6c去除單核細胞及中性粒細胞，最后用流式細胞儀 (BD FACSAria)分選CD11c+IA/IE+ DC。分選策略如圖2所示。

圖2 肺部DC分選策略

2.2 DC趨化的CD4+T細胞統(tǒng)計 將分選出的肺部 DC 注射入小鼠背部氣泡內(nèi)12 h后，用PBS沖洗氣泡并收集沖洗液，流式抗體染色，流式細胞儀檢測分析各組內(nèi)氣泡內(nèi)CD4+T細胞的數(shù)目，結(jié)果與僅注射PBS的對照組相比，注射哮喘小鼠肺部DC組趨化至氣泡內(nèi)的CD4+T細胞顯著上升。說明哮喘中肺部DC在在體內(nèi)可以直接趨化CD4+T細胞。

表1 氣泡小鼠中肺部DC對CD4+T細胞的趨化作用

注：與PBS 對照組相比，*P<0.05。

圖3 氣泡小鼠中趨化CD4+T細胞數(shù)目

3 討 論

過敏性哮喘患者體內(nèi)THl/TH2免疫調(diào)節(jié)失衡是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要機制，肺與氣道粘膜中TH2細胞因子高表達，使TH1/TH2為主的免疫平衡向TH2傾斜，從而導(dǎo)致氣道發(fā)生慢性炎癥[3]。過敏性哮喘作為I型超敏反應(yīng)，過敏性炎癥的發(fā)生分為各個階段，誘導(dǎo)階段主要細胞為抗原提呈細，而DC是功能最強大的抗原提呈細胞，它們能夠捕獲外來抗原并且遷移到引流淋巴結(jié)，然后提呈給初始T細胞刺激免疫應(yīng)答[5]。在某些病理狀態(tài)下DC與初始T細胞結(jié)合力的變化會更加促進初始T細胞向TH2 型細胞的轉(zhuǎn)變，有研究發(fā)現(xiàn)過敏體質(zhì)的人群中，DC 會刺激初始T細胞向 TH2 方向分化。此外DC在遷移成熟中還可激活會刺激初始T細胞分化成記憶性T細胞,之后DC再次激活記憶性T細胞，在隨后的自身免疫損傷中發(fā)揮重要作用[6]。本研究表明，哮喘中肺部DC在體內(nèi)可以直接趨化CD4+T細胞。DC 與支氣管哮喘發(fā)病機制的深入研究為哮喘治療提供了新的方向。

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Chemotaxis study of pulmonary dendritic cells in vivo during allergic asthma

NIU Rui LIN Yan WANF Peng YI Shu-ying

(Taishan Medical University, Taian 271000,China)

Objective: To study the direct effect of dendritic cells (DC) on CD4+T lymphocytes in allergic asthma, and to explore whether DC can directly induce CD4+T lymphocytes in asthmatic mice, we performed this research. This study will provide a new direction for the treatment of asthma. Methods: Pulmonary DCs were sorted from the C57BL/6 asthmatic mice, and injected into the dorsal air pouches of the mice. The number of CD4+T lymphocytes in the air pouches was detected by flow cytometry after 12 hours of cell injection. Results: Compared with PBS control, the chemotactic CD4+T lymphocytes increased significantly after the DC injection. Conclusion: This study indicates that lung DCs in asthmatic mice can directly induce CD4+T lymphocytes in vivo.

allergic asthma; dendritic cells; CD4+T lymphocytes

國家自然科學(xué)基金項目(81401328 )，山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2013HL064)，國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610439035)。

牛睿(1990—)，女，碩士研究生。

伊淑瑩(1979—)，女，博士，副教授，主要從事超敏反應(yīng)性疾病研究，E-mail：shuyingyi79@163.com.cn。

R563

A

1004-7115(2017)01-0006-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.01.002

2016-09-22)