安麗營 李楊 楊斌

130021吉林大學(xué)第一醫(yī)院基因診斷中心1

130033吉林大學(xué)第三醫(yī)院乳腺外科2

質(zhì)譜在乳頭溢液中的應(yīng)用進(jìn)展

安麗營1李楊2楊斌2

130021吉林大學(xué)第一醫(yī)院基因診斷中心1

130033吉林大學(xué)第三醫(yī)院乳腺外科2

乳頭溢液在臨床中較常見。本文就乳頭溢液的定義、產(chǎn)生的原因、常用乳頭溢液的檢查方法進(jìn)行綜述，重點(diǎn)總結(jié)質(zhì)譜在乳頭溢液中的應(yīng)用。

乳頭溢液；檢查方法；質(zhì)譜

乳頭溢液產(chǎn)生的原因

乳頭溢液是指乳頭自然流出液體。乳頭溢液包括生理性溢液和病理性溢液。生理性溢液是指哺乳期或產(chǎn)褥期乳頭自然流出的乳白色液體，如乳汁。病理性溢液是指非哺乳期或產(chǎn)褥期乳乳頭流出的液體。病理性溢液主要分3類，一類是乳管自身病變，囊腫或乳管上皮細(xì)胞增生，在乳管內(nèi)形成一個(gè)或多個(gè)乳頭狀瘤或乳頭狀癌；一類是下丘腦垂體腺瘤，泌乳素分泌紊亂，形成溢液[1]；另一類是服用某些藥物導(dǎo)致溢液，如鎮(zhèn)靜藥、口服避孕藥等[2]。

乳頭溢液顏色

乳白色溢液：可見于生理性的乳頭溢液，即哺乳期乳頭溢液。多見于哺乳期或哺乳期過后回乳不徹底的女性。在未擴(kuò)開乳管的情況下，輕輕擠壓乳房即可有乳汁產(chǎn)生；還可見于停止哺乳幾年后的女性，乳汁形成囊腫，擴(kuò)開乳管后，可有乳汁從乳頭排出，少見于在任意年齡由于機(jī)械刺激而產(chǎn)生乳汁樣溢液；乳白色溢液還可見于病理性乳頭溢液，多見于停止哺乳多年，在未擴(kuò)開乳管的情況下，擠壓乳房可見黏稠乳白色液體從乳頭流出，主要原因一是垂體病變導(dǎo)致泌乳素分泌異常增高，二是長期服用鎮(zhèn)靜藥、避孕藥。

有色溢液：有色溢液包括淡黃色血清樣溢液和血性溢液。有研究表明，這兩種顏色的乳頭溢液具有相同的臨床意義[3]。70%的有色溢液患者經(jīng)病理診斷為乳頭狀瘤，10%的有色溢液為乳頭狀癌。

無色水樣液單孔或多孔無色水樣溢液，并不少見，多為乳管擴(kuò)張所致。

乳頭溢液的檢查方法

乳腺X線照相術(shù)：乳腺X線照相術(shù)是較早的應(yīng)用于乳腺的檢查，通過觀察X線片上鈣化、腫塊形態(tài)、大小和位置可查明乳頭溢液原因[4]。其優(yōu)點(diǎn)：①快速簡單。②價(jià)格便宜。

缺點(diǎn)：①有一定的局限性，區(qū)分乳頭溢液良惡性的敏感度約20%～25%[5～7]，即便乳腺X線片提示乳頭溢液結(jié)果為陰性，也不能排除其是惡性的可能。②暴露于X線的劑量不可避免，多次照射會(huì)增加誘發(fā)乳腺癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是攜帶BRCA1/2易感基因的年輕女性。③在乳腺X線照相時(shí)擠壓乳頭，給患者帶來一定的疼痛和不適。④年齡＜40歲者不建議使用，年齡在40～49歲的使用存在爭議：年輕女性的乳腺組織稠密，降低了乳腺X線照相術(shù)的敏感性。

乳腺超聲：乳腺超聲是大部分患者的首選檢查，應(yīng)用較乳腺X線照相術(shù)晚。主要是通過超聲波獲得聲像圖，根據(jù)聲像圖上回聲的強(qiáng)度、聲影來區(qū)分乳腺的良惡性。其優(yōu)點(diǎn)：①更加便捷。②對乳管內(nèi)病理性乳頭溢液敏感性要好于乳腺X線照相術(shù)。研究表明，其敏感性約60%，特異性約75%～85%。

缺點(diǎn)：①不能連續(xù)探測乳管內(nèi)的情況。②當(dāng)周邊乳管內(nèi)腫瘤較小時(shí)，不易探測到。③不能區(qū)分乳管內(nèi)腫瘤的性質(zhì)。

乳腺導(dǎo)管造影術(shù)：乳腺導(dǎo)管造影術(shù)早于乳腺X線照相術(shù)和乳腺超聲。通過溢液乳管注入造影劑，來探測和定位乳管內(nèi)的腫瘤。其優(yōu)點(diǎn)：①定位乳管內(nèi)的腫瘤在乳管的位置。②當(dāng)乳管內(nèi)有腫物時(shí)，注入造影劑可縮小乳腺腺體的切除范圍。

缺點(diǎn)：①當(dāng)溢液乳管不溢液時(shí)，無法行造影術(shù)。②造影劑會(huì)引起部分患者過敏，發(fā)生過敏反應(yīng)，給患者帶來不必要的痛苦。③不能區(qū)分乳管內(nèi)腫物的良惡性。

細(xì)胞涂片檢查：乳頭溢液涂片檢查是存在爭議的，現(xiàn)在不推薦作為常規(guī)的檢查方法。其優(yōu)點(diǎn)：①操作過程簡單，即涂片、固定、染色。②涂片取樣是無痛的。③若圖片結(jié)果為陽性，可做出病因?qū)W的診斷。

缺點(diǎn)：①經(jīng)研究證實(shí)其敏感性低，需重復(fù)操作，多次進(jìn)行復(fù)檢[8]。②需要有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞學(xué)專家采集樣本。③細(xì)胞學(xué)結(jié)果和乳管損傷缺乏相關(guān)性。

乳管內(nèi)鏡檢查：乳管內(nèi)鏡檢查技術(shù)在最近20年來發(fā)展迅速。我國在1988年從日本引進(jìn)，由內(nèi)鏡和放大60倍的顯示器組成，主要應(yīng)用于對乳頭溢液的檢查。優(yōu)點(diǎn)：①對乳頭溢液的患者，乳管鏡可直接從溢液的乳管開口處進(jìn)入，可在直視下連續(xù)觀察乳管形態(tài)。②可明確乳管內(nèi)腫物形態(tài)及深度。③可收集溢液乳管的灌洗液，行細(xì)胞學(xué)檢查。灌洗液的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果與乳管鏡下觀察到的形態(tài)有關(guān)聯(lián)[9]。④對于乳管內(nèi)占位病變可行活組織病理檢查。⑤通過探針定位病損乳管，縮小手術(shù)切除范圍。

缺點(diǎn)：乳管在常態(tài)下處于閉合狀態(tài)，擴(kuò)開乳管時(shí)，部分患者感到疼痛。

質(zhì) 譜

質(zhì)譜又稱質(zhì)譜法，是一種與光譜并列的譜學(xué)方法。質(zhì)譜分析法是化合物形成離子和碎片離子，按照其質(zhì)/荷比的不同進(jìn)行分離測定，對其結(jié)構(gòu)和成分分析的一種分析方法。其基本原理是樣品中組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)/荷比的帶電離子，在加速電場的作用下，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中利用電場和磁場的作用，將其分別聚焦，形成質(zhì)譜圖，從而確定所測物質(zhì)質(zhì)量。質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)多，例如應(yīng)用范圍廣泛、靈敏度及特異度高、所需樣品少等。質(zhì)譜儀的種類很多，根據(jù)應(yīng)用范圍的不同，主要包括有機(jī)質(zhì)譜和無機(jī)質(zhì)譜。有機(jī)質(zhì)譜有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；無機(jī)質(zhì)譜有火花源雙聚焦質(zhì)譜儀、感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀、二次離子質(zhì)譜儀，還有質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用等多種類型。

質(zhì)譜的應(yīng)用范圍非常廣泛。其中質(zhì)譜成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用技術(shù)較成熟[10]。在生物化學(xué)方面，質(zhì)譜可以被用來研究多糖的結(jié)構(gòu)和多糖在生物系統(tǒng)中的功能，尤其是在糖蛋白的分析上。在過去的10年里，質(zhì)譜讓人們對糖類在生物中的作用有了更深的認(rèn)識(shí)[11]。在微生物學(xué)方面，應(yīng)用質(zhì)譜探測微生物的代謝分子，并且應(yīng)用多種質(zhì)譜技術(shù)，不僅使人們在微生物分子水平上的認(rèn)識(shí)更加深入，更使人們對微生物的化學(xué)世界有了前所未有的洞悉[12]。在臨床醫(yī)學(xué)方面，質(zhì)譜應(yīng)用于鱗狀肺癌切除術(shù)術(shù)中，用于確定切除腫瘤后瘤周組織的切除范圍。傳統(tǒng)的方法是以冰凍組織病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，但其存在一個(gè)缺點(diǎn)，即復(fù)雜的分析流程。整個(gè)過程需要30～40 min。而質(zhì)譜可以實(shí)時(shí)地在1 min內(nèi)用少量的樣本進(jìn)行檢測，其判定的準(zhǔn)確度高達(dá)94.42%[13]?？梢娰|(zhì)譜在外科手術(shù)、治療干預(yù)上有一定的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)在質(zhì)譜應(yīng)用于小分子的結(jié)構(gòu)分析在生命科學(xué)領(lǐng)域起著重要的作用。質(zhì)譜是研究分子和混合物結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。

乳管內(nèi)液成分

乳腺疾病已成為全球女性非常常見的和致死性疾病，盡管現(xiàn)在乳腺疾病的死亡率呈下降趨勢，但是乳腺疾病的預(yù)后和治療的局限性都堪憂。所以，了解乳腺疾病在分子結(jié)構(gòu)上的最初改變和發(fā)展至關(guān)重要。在這方面，乳管內(nèi)液成分的改變正逐漸受到關(guān)注。乳管內(nèi)液是乳管上皮細(xì)胞產(chǎn)生、分泌和重吸收的物質(zhì)，其中含有多種成分，包括蛋白質(zhì)(胰蛋白酶、血漿銅藍(lán)蛋白、前白蛋白、脂蛋白等)、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgE、IgD)、脂肪酸、激素(催乳素、雌二醇、孕酮等)、離子(Na+、K+、Ca2+等)、細(xì)胞(上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)[14]。

離子：鋁離子并不是人體組織中生理組成的一部分[15]，但鋁的混合物卻可以通過很多物質(zhì)接觸到人體，如食品添加劑、化妝品、家用家具等。而乳腺也可以接觸到以鋁離子為主要成分的各種各樣的物質(zhì)，包括飲食[16]，以及腋下使用的防汗藥[17]。很多研究者測量鋁離子在乳腺組織的含量，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤比鄰近正常組織中鋁離子的含量相對較高[18]。Mannello F等人研究得出在乳腺癌患者乳管內(nèi)液中鋁離子的含量較正常乳腺或良性乳腺乳管內(nèi)液中鋁離子的含量高(210 vs 125 μg/L)。在非乳腺癌患者中，乳管內(nèi)液中鋁離子的含量在絕經(jīng)前后無差異；但是在乳腺癌患者中，絕經(jīng)后女性乳管液中鋁離子的含量較絕經(jīng)前女性高[(275±33)vs(210±57)μg/L][19]。在乳腺癌患者的乳管液中除了鋁離子的含量高，炎性細(xì)胞刺激因子含量也相對較高，而在非乳腺癌患者的乳管液中則相反。而炎性反應(yīng)在乳腺微環(huán)境中和乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素相關(guān)。可見，鋁離子在乳管內(nèi)液中起著重要的作用。鐵元素是人體健康必不可少的元素之一，在體內(nèi)無論含量過多還是過少都會(huì)對健康構(gòu)成威脅。Ferdinando Mannello等人研究鐵在體內(nèi)的平衡對乳腺微環(huán)境的影響中顯示，鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白在乳腺癌患者乳頭抽吸液中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非乳腺癌患者。研究還顯示，鐵在體內(nèi)的平衡受鋁離子的調(diào)控，鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量與鋁離子的積累有一定的相關(guān)性[20]。乳腺微環(huán)境中的Fe2+在AlO22-的作用下轉(zhuǎn)化成Fe3+，增加了微環(huán)境內(nèi)的氧化損傷，這種氧化應(yīng)激在乳腺微環(huán)境中和乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素相關(guān)。可見鐵離子在乳管內(nèi)液中也有著重要的地位。

糖類-乳糖：乳糖存在于乳管的分泌物中被認(rèn)為是乳房分泌活動(dòng)的生物化學(xué)證據(jù)。Nicholas L Petrakis等人發(fā)現(xiàn)乳糖存在于經(jīng)產(chǎn)婦或未生育的年輕女性的乳管液中。這一發(fā)現(xiàn)暗示了一些非妊娠期的婦女乳房受催乳素的刺激。因此，乳糖可以作為簡單的標(biāo)記來提示乳腺的生理分泌活動(dòng)[21]。乳糖是乳汁中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是具有滲透性質(zhì)的物質(zhì)，處于泌乳期的乳腺，乳糖的滲透作用促使人體內(nèi)的水分流入乳管，增加了乳汁的體積[22]。通過乳糖的滲透作用，有研究者發(fā)現(xiàn)乳糖按規(guī)律的飲食攝入作為可調(diào)節(jié)的因素，可以用來改變女性乳管內(nèi)的分泌。這一發(fā)現(xiàn)有助于乳管內(nèi)液作為探測乳腺疾病的診斷依據(jù)[23]。

激素：乳腺受人體體內(nèi)雌性激素水平的調(diào)節(jié)，乳腺癌和雌激素水平及狀態(tài)有關(guān)。許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)伴隨著女性月經(jīng)周期的變化，乳管內(nèi)液中的雌激素含量較血清的雌激素含量高[24～28]。這是因?yàn)槿楣軆?nèi)的上皮細(xì)胞在芳香酶和硫酸酯酶的作用下能夠合成雌激素。同時(shí)，Chatterton等人證實(shí)乳管內(nèi)液中含有大量的雌激素前體物質(zhì)[29]。而且，乳管內(nèi)液的雌激素水平也受口服避孕藥和激素替代療法的影響。乳腺的每一個(gè)乳管的內(nèi)環(huán)境是不同的。Khan等證實(shí)每一個(gè)乳管內(nèi)的雌激素和雌激素前體的含量不同[30]。這也解釋了為什么一個(gè)乳頭會(huì)同時(shí)有不同顏色的溢液。

細(xì)胞：乳管的微環(huán)境由細(xì)胞外基質(zhì)和各種基質(zhì)細(xì)胞組成，細(xì)胞和細(xì)胞之間、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用。它們之間的相互作用影響乳腺的正常功能和異常病變。在正常的乳腺中乳管腔內(nèi)的大部分上皮細(xì)胞和基質(zhì)膜是不直接接觸的，它們之間有一層肌上皮細(xì)胞，細(xì)胞的基質(zhì)包括白細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。在原位導(dǎo)管癌的乳管中，這些肌上皮細(xì)胞顯著減少，而基質(zhì)的纖維母細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞隨著腫瘤病變程度而增多。可見，乳管微環(huán)境的變化對乳腺是有影響的[31]。

質(zhì)譜在乳頭溢液中的應(yīng)用

人類基因組計(jì)劃在科學(xué)的探索上逐漸趨向蛋白質(zhì)的研究。最初對正常和疾病的組織使用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)2D-PAGE鑒定和區(qū)分蛋白質(zhì)表達(dá)。應(yīng)用這種方法檢測出在乳管抽吸液中有64種蛋白質(zhì)，其中又有15種蛋白質(zhì)在乳腺癌患者的血清或乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。后來，Alexander等人將2D-PAGE和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI)技術(shù)相結(jié)合，明確乳管抽吸液中與乳腺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)成分。但由于2D-PAGE技術(shù)需要大量的樣本和人力，因此應(yīng)用于臨床存在困難。因此，用于檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)其他質(zhì)譜技術(shù)逐漸被發(fā)展起來，表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF)被應(yīng)用，結(jié)合質(zhì)譜分析分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。和以前的蛋白質(zhì)分析技術(shù)相比，其最大的優(yōu)點(diǎn)為能夠提供快速的蛋白質(zhì)譜。SELDI這項(xiàng)技術(shù)優(yōu)于其他的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，還因?yàn)槠渌璧脑牧献钌賉32]，不需要用高效液相色譜或氣相色譜分離復(fù)雜的混合物。

目前SELDI-TOF技術(shù)被應(yīng)用在與乳腺癌相關(guān)的乳管抽吸液中生物標(biāo)識(shí)物的檢測。Sauter等人從乳管抽吸液中確定了5種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。和健康女性的乳管抽吸液相比，這5種蛋白質(zhì)離子 團(tuán) (6500、 8000、 15940、 28100 和31770)頻繁出現(xiàn)在乳腺癌患者的乳管抽吸液中[33]。除此之外，用這種質(zhì)譜技術(shù)還可以進(jìn)一步研究乳腺良性病變、乳管非典型增生、乳腺導(dǎo)管原位癌和炎癥乳腺癌中蛋白質(zhì)的改變，有利于乳腺癌的早期診斷。

此外，Edward等人應(yīng)用SELDI-TOF證明乳管液中的β-酪蛋白肽就與乳腺癌有關(guān)。β-酪蛋白肽因此可以作為檢測乳腺癌的生物標(biāo)記物之一。在乳管抽吸液中有一系列的蛋白質(zhì)存在，并且和乳腺癌有著密切的關(guān)系。因此，可以將乳管抽吸液中蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種非侵略性的方法來檢測與乳腺癌相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記和乳腺癌的早期診斷。

質(zhì)譜除了應(yīng)用于乳管抽吸液中檢測蛋白組學(xué)，還可以檢測小分子代謝物。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的另外一種研究生物代謝途徑的技術(shù)。它的特點(diǎn)是可以描繪人體組織或液體的小分子組成。代謝物的組成標(biāo)志著生物的中點(diǎn)，它能夠反映一種疾病的遺傳、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)。這是因?yàn)樾》肿邮怯傻鞍踪|(zhì)產(chǎn)生和修飾。使用代謝組學(xué)作為腫瘤的一種標(biāo)志物是對新陳代謝在腫瘤中扮演著重要角色的認(rèn)識(shí)[34]。在代謝組學(xué)中，質(zhì)譜是主要的技術(shù)之一。質(zhì)譜分析代謝組學(xué)的復(fù)雜之處在于，在分析之前需要?dú)庀嗌V或液相色譜分離樣本[35]。

Gregory D等人用核磁共振(NMR)和氣相色譜聯(lián)合質(zhì)譜(GC-MS)的方法描述乳管抽吸液[36]，他們證明了用NMR和GC-MS獲得乳管抽吸液代謝譜的可行性和乳管抽吸液代謝譜不同于血液代謝譜。而且，希望通過研究乳管抽吸液的代謝物組成可以起到預(yù)防、診斷、治療乳腺癌的作用。

綜上所述，乳頭溢液有別于乳頭抽吸液，由于人們?nèi)狈Χㄆ跈z查的意識(shí)，往往是機(jī)體出現(xiàn)癥狀時(shí)才想到檢查如發(fā)現(xiàn)乳頭有溢液后，我們可以通過收集乳頭溢液，用色譜-質(zhì)譜儀篩查乳腺癌，預(yù)測就診者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，無論是乳頭抽吸液還是乳頭溢液都只是在試驗(yàn)階段，尚未應(yīng)用到臨床中。可能存在的問題：①質(zhì)譜應(yīng)用于乳頭抽吸液或溢液的方法尚待進(jìn)一步研究。②應(yīng)用質(zhì)譜測生物液體的蛋白組學(xué)還是代謝組學(xué)的生物標(biāo)記物尚不明確。③質(zhì)譜的儀器及相關(guān)儀器價(jià)格相對較貴。希望質(zhì)譜可以盡早應(yīng)用于臨床檢測，在乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療方面發(fā)揮作用。

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Advances in the application of mass spectrometry in nipple discharge

An Liying1,Li Yang2,Yang Bin2The Gene Diagnosis Center of No.1 Hospital of Jilin University 1300211
Department of Breast Surgery,the Third Hospital of Jilin University 1300332

Nipple Discharge is common in clinic.This article reviews the definition,the causes and the examination methods of nipple discharge.We focus on the summary of the application of mass spectrometry in nipple discharge.

Nipple discharge;Examination methods;Mass spectrometry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.31.1