譚德冠 彭晶 付莉莉 孫雪飄 韓冰瑩 張家明

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海南?？?571101）

橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell.Arg.）屬大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經(jīng)濟林木。其樹皮被定期開割，樹皮中被割斷的乳管排出牛奶狀膠乳（細胞質(zhì)），經(jīng)收集和加工后成為重要的工業(yè)原料——天然橡膠[1]。全球商品天然橡膠的99%來源于橡膠樹[2]。

圖1 組織化學(xué)染色法鑒定未授粉胚珠來源的愈傷組織中乳管細胞

植物乳管是指含有膠乳的高度特化細胞，是橡膠樹合成和貯存膠乳的場所[3]；橡膠樹莖干樹皮乳管數(shù)量與其產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系[4-5]。因此橡膠樹乳管分化機制的研究成為科技人員的重要課題之一。目前大部分科技人員以橡膠樹樹皮作為模型開展乳管分化機制的研究并取得一定進展。發(fā)現(xiàn)外源茉莉酸（JA）能顯著促進樹皮乳管細胞分化[6]；從橡膠樹中克隆了HbSKP1、HbJA1、HbCOI1、HbLAP1、HblMYC1、HblMYC2、HbEREBP1等[7-10]與JA信號途徑相關(guān)的基因。一些學(xué)者以橡膠樹的花藥愈傷組織為模型開展乳管分化研究，發(fā)現(xiàn)JA、茉莉酸甲酯（MeJA）也能促進愈傷乳管細胞分化[11-12]。

橡膠樹的未授粉胚珠是其組織培養(yǎng)外植體來源之一[13-14]。與花藥等其他外植體相比，未授粉胚珠具有容易消毒、能完全避免污染的優(yōu)勢，此外未授粉胚珠與花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率相近[15]。因此，以未授粉胚珠來代替花藥等其他外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并以該來源的愈傷組織為模型研究乳管分化機制，可能具有工作量少、效率高等優(yōu)勢。目前尚不清楚橡膠樹未授粉胚珠來源的愈傷組織是否存在乳管細胞及其分化情況。本研究通過組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、分子生物學(xué)法證實未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細胞，并發(fā)現(xiàn)JA能促進未授粉胚珠愈傷乳管細胞分化，其分化依賴于橡膠樹基因型，為研究乳管分化機制的模型提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊采集橡膠樹品種熱研7-33-97、熱研88-13、熱研8-79的花枝，立即置于4℃冰箱中貯存24 h。

1.2 方法

1.2.1 試材制備用鑷子收集未開放的雌花，75%（V/V）酒精消毒1 min，無菌水清洗1遍，0.1%升汞消毒10 min，無菌水清洗5次。在無菌條件下用解剖針剖開雌花挑出胚珠，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為25℃暗培養(yǎng)。誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的組分是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2 mg/L 2,4-D，0.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA，7%（m/V）蔗糖，植物凝膠2.2 g/L，調(diào)整pH至5.8。

1.2.2 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細胞參照田維敏等[16]報道的組織化學(xué)法鑒定未授粉胚珠愈傷組織中的乳管細胞。取培養(yǎng)至70 d的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織于80%酒精中室溫固定2 d，酒精系列脫水，60℃下溴-碘溶液染色48 h，冰醋酸清洗2次，再進行滲蠟、包埋，滑走切片機（Leica，德國）切片，貼片，二甲苯脫蠟，固綠染色，中性樹膠封片。將制備好的切片于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細胞參照Tan等[17]報道的免疫組織化學(xué)方法鑒定未授粉胚珠愈傷組織中的乳管細胞。取上述固定好的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織，酒精系列脫水后進行滲蠟、包埋、切片、貼片，二甲苯脫蠟。將樣品置于95℃的0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液中處理15 min，PBS緩沖液清洗3次，2%牛血清蛋白（BSA）封閉30 min。將樣品置于保濕盒中，加入一抗[小橡膠粒子蛋白（Small Rubber Particle Protein，SRPP）兔抗]，按1:100稀釋于含1% BSA的PBS緩沖液）后4℃處理過夜，PBS緩沖液清洗3次后，加入二抗（羊抗兔，按1:50稀釋于含1% BSA的PBS緩沖液），37℃下處理1 h，PBS緩沖液清洗3次；樣品用DBT/BCIP堿性磷酸酶顯色液浸泡5 min，酒精系列脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 橡膠合成相關(guān)基因片段的擴增取培養(yǎng)70 d的熱研7-33-97未授粉胚珠愈傷組織，采用北京TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取其總RNA，再用Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。根據(jù)從NCBI網(wǎng)站上查找到與橡膠合成相關(guān)的基因SRPP基因序列（AJ223388）、橡膠延伸因子（Rubber Elongation Factor,REF）基因序列（X56535.1），采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，其中SRPP基因引物對為SRPP-F（5'-GAAGAGGTGGAGGAAGAG-3'）、SRPP-R（5'-CAAAGGCAAATAA GAGGA-3'），REF基因引物對為REF-F（5'-GGCTGAAGACGAAGACAA-3'）、REF-R（5'-GCAAAGAAG AAGCCAGAG-3）。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)進行35個循環(huán)，最后72℃補平10 min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序。

1.2.5 JA對未授粉胚珠愈傷乳管細胞分化的影響在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上分別加入0、1、2、3、4 mg/L的JA，將熱研7-33-97的未授粉胚珠接種于含不同濃度JA的培養(yǎng)基中，25℃下暗培養(yǎng)。80%酒精固定培養(yǎng)至70 d的各處理愈傷組織，經(jīng)酒精系列脫水，按1.2.2方法進行組織化學(xué)染色和制片。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計不同濃度JA處理的愈傷乳管細胞發(fā)生頻率。乳管細胞發(fā)生頻率=（乳管細胞數(shù)量/總的細胞數(shù)量）×100%。

1.2.6 不同橡膠樹基因型對未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化的影響分別取在相同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下培養(yǎng)70 d的熱研7-33-97、熱研88-13、熱研8-79未授粉胚珠愈傷組織固定于80%酒精中，酒精系列脫水，按1.2.2方法進行組織化學(xué)染色和制片。光學(xué)顯微鏡下觀察不同基因型的未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細胞

組織化學(xué)法是一種被廣泛應(yīng)用、經(jīng)典的鑒定植物組織中乳管細胞的方法[18]。當(dāng)培養(yǎng)至70 d時，未授粉胚珠分化出的愈傷組織呈淺黃色，表面結(jié)構(gòu)緊密（圖1-A）。經(jīng)溴-碘染色液處理后發(fā)現(xiàn)，愈傷組織存在棕色的細胞(圖1-B、1-C)，這些細胞為乳管細胞，其內(nèi)含物橡膠被溴-碘染色液處理后變成不溶于二甲苯的、棕色的變性橡膠。愈傷組織中還存在黑褐色的細胞，這些細胞為單寧細胞（圖1-C），其單寧物質(zhì)被染色液染成黑褐色。此外，愈傷組織中還存在淀粉細胞（圖1-D），該類細胞中充滿顆粒狀淀粉。

2.2 免疫組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細胞

為進一步驗證未授粉胚珠來源的愈傷組織是否存在乳管細胞，對該愈傷組織進行了免疫組織化學(xué)研究。對愈傷組織的切片進行一抗為SRPP兔抗的處理，該抗體SRPP蛋白能與切片中乳管細胞的SRPP底物特異結(jié)合，經(jīng)羊抗兔的二抗處理，再經(jīng)DBT/BCIP堿性磷酸酶顯色液顯色發(fā)現(xiàn)，愈傷組織切片中存在藍黑色的細胞（圖2），這些細胞為乳管細胞。免疫組織化學(xué)法證實了未授粉胚珠來源的愈傷組織存在乳管細胞。

圖2 免疫組織化學(xué)法鑒定未授粉胚珠來源的愈傷組織中乳管細胞

2.3 橡膠合成相關(guān)基因片段的擴增

SRPP、REF是附于小橡膠粒子膜的蛋白質(zhì)，它們是參與橡膠生物合成的重要酶和調(diào)控因子，編碼SRPP、REF基因在橡膠樹膠乳細胞中特異表達[19-20]。在本研究中，RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，從橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織的cDNA中均能擴增出清晰的SRPP、REF基因片段目的條帶（圖3）。經(jīng)測序分析，SRPP、REF基因片段的目的條帶分別為571、355 bp，經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹膠乳表達的基因序列相一致。這從分子水平上進一步證實未授粉胚珠愈傷組織存在乳管細胞，它們的功能與樹皮乳管細胞相類似。

圖3 RT-PCR擴增膠乳合成相關(guān)基因片段電泳圖

2.4 JA對橡膠樹未授粉胚珠愈傷乳管細胞分化的影響

施加外源JA已被證實具有促進橡膠樹樹皮乳管分化的功能[6]，但目前尚不清楚是否對未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞具有效果。在本研究中，筆者將不同濃度的JA添加于誘導(dǎo)愈傷的組織培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JA會顯著影響未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化：當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為1 mg/L時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率增加至8.8%，顯著高于其他處理（圖4）。當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為2、3 mg/L時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率分別下降至5.8%、5.4%，略低于對照（6.2%），但三者在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著。當(dāng)培養(yǎng)基中JA濃度為4 mg/L時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率下降至2.3%，顯著低于其他處理（圖4）。在JA濃度1～4 mg/L時，隨著JA濃度升高，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率呈逐步下降趨勢（圖4）。這些結(jié)果表明，低濃度的JA能促進未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化，而高濃度的JA會抑制未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化，其中以JA濃度為1 mg/L效果最佳。

圖4 JA對未授粉胚珠來源的愈傷組織乳管細胞分化的影響

2.5 不同橡膠樹基因型對未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化的影響

在培養(yǎng)條件一致的條件下對3個橡膠樹品種的未授粉胚珠的愈傷乳管細胞發(fā)生頻率進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，不同橡膠樹基因型其未授粉胚珠愈傷乳管細胞發(fā)生頻率存在差異。熱研7-33-97與熱研8-79的未授粉胚珠愈傷乳管細胞發(fā)生頻率較接近，分別為6.2%與5.9%，在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異，但均顯著高于熱研88-13（3.2%）（圖5）。熱研88-13的未授粉胚珠愈傷乳管細胞發(fā)生頻率最低，比熱研7-33-97、熱研8-79分別低94%、84%（圖5）。上述結(jié)果表明，未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化依賴于橡膠樹基因型。

圖5 不同橡膠樹基因型的未授粉胚珠來源的愈傷組織乳管細胞分化頻率的比較

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究通過組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)法證實未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細胞；RT-PCR結(jié)果顯示，SRPP、REF基因均能從未授粉胚珠愈傷組織cDNA中擴增出來，經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹膠乳表達的基因序列相一致，表明未授粉胚珠愈傷乳管細胞，能表達與樹皮乳管細胞相一致的、與膠乳合成相關(guān)的特異基因；同時發(fā)現(xiàn)，未授粉胚珠愈傷乳管細胞與樹皮乳管細胞一樣[6,21]，它們的分化受外源JA調(diào)控。這些結(jié)果為橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織可作為研究乳管分化機制的模型提供充分的實驗依據(jù)。

目前已報道的用于研究橡膠樹乳管分化的愈傷組織模型來源于橡膠樹花藥[17]、莖段[5]、葉柄[22]等外植體。橡膠樹長期生長在高溫潮濕的環(huán)境下，該環(huán)境富含微生物[23]，其莖段和葉柄均長期暴露于外界環(huán)境中，環(huán)境中的微生物極易滋生在它們的皮層表面，并可能進一步侵染進它們的皮層細胞間/內(nèi)；橡膠樹的花藥在發(fā)育早期被花被緊密包裹，但在發(fā)育至單核期時，花被包裹花藥并不緊密，外界環(huán)境的微生物會通過雨水等媒介侵染至花藥中，使花藥組織不再處于無菌環(huán)境。因此以橡膠樹花藥、莖段、葉柄等作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，存在污染率高的缺點。未授粉胚珠被橡膠樹的子房緊密包裹住，屬無菌環(huán)境，因此以其為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，能完全避免污染現(xiàn)象發(fā)生。同時未授粉胚珠接種效率遠高于花藥[15]。因此，以未授粉胚珠來源的愈傷組織為模型，研究橡膠樹乳管細胞分化機制，可能具有工作量少、效率高等優(yōu)勢。

外源JA已被證實具有促進橡膠樹樹皮乳管細胞分化，從而增加乳管細胞數(shù)量的功能，但報道中只具有正調(diào)控橡膠樹乳管分化的效果[6,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度JA具有正調(diào)控橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管分化效果，而高濃度JA具有負調(diào)控橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管分化效果，因此，如果以未授粉胚珠愈傷組織為模型研究乳管分化可能會獲取更多的生物學(xué)信息。

本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)70 d的橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細胞，但該乳管細胞來源尚不清楚。該乳管細胞可能由胚珠組織中的乳管細胞分化產(chǎn)生，也可能由愈傷組織中薄壁細胞分化產(chǎn)生，因此需要對未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞的整個分化過程進行系統(tǒng)研究。

自然界中存在12 500種含膠乳植物，它們分屬22個科900個屬[24]，但目前尚未有其他植物未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細胞的報道。含膠植物乳管細胞的主要功能是起防御作用，除合成和貯存橡膠外，還會分泌一些有毒代謝物來保護植物體免受外來侵害[25]。目前尚不清楚橡膠樹未受粉胚珠愈傷組織的乳管細胞是否也存在防御功能，需要對它們的代謝產(chǎn)物成分作深入研究。

3.2 結(jié)論

本研究采用組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、分子生物學(xué)法證實未授粉胚珠愈傷組織中存在乳管細胞。RT-PCR結(jié)果顯示，小橡膠粒子蛋白（SRPP）、橡膠延伸因子（REF）基因均能從未授粉胚珠愈傷組織cDNA中擴增出，Blast比對發(fā)現(xiàn)，它們的序列與已知的橡膠樹樹皮膠乳表達的基因序列相一致，表明其功能與樹皮乳管細胞相似。培養(yǎng)基中添加低濃度的茉莉酸(JA)能促進未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化，而高濃度的JA會抑制其分化，JA濃度以為1 mg/L效果最佳。橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織乳管細胞分化依賴于基因型。本研究的結(jié)果為橡膠樹未授粉胚珠愈傷組織可作為研究乳管分化機制的模型提供實驗依據(jù)，對促進乳管分化機制研究具有一定意義。