馬群飛

GB 4789.35－2016《乳酸菌檢驗(yàn)》解讀

馬群飛

對(duì)GB 4789．35－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》的范圍、術(shù)語和定義、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗(yàn)程序、操作步驟、結(jié)果與報(bào)告、乳酸菌的鑒定、培養(yǎng)基及試劑等章節(jié)逐條進(jìn)行分析解讀。討論了標(biāo)準(zhǔn)變化的依據(jù)以及存在的問題，對(duì)食品微生物實(shí)驗(yàn)室正確實(shí)施使用該標(biāo)準(zhǔn)提出了技術(shù)性建議。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；食品安全；乳酸菌；檢驗(yàn)

2017年1月9日，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)網(wǎng)站公布了一系列新的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（以下簡(jiǎn)稱2016版標(biāo)準(zhǔn)）實(shí)施日期為2017年6月23日[1]。2010年6月1日開始實(shí)施的GB 4789.35-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[2]，因?yàn)樵诜椒ㄔ?、操作步驟等方面比以往版本變化很大，加上標(biāo)準(zhǔn)宣貫沒有及時(shí)跟進(jìn)，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)困惑較多，實(shí)際工作中也出現(xiàn)了較多偏差，影響了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施效果。在2016版標(biāo)準(zhǔn)的前言中，對(duì)于修改了定義、檢驗(yàn)程序、培養(yǎng)基和試劑等章節(jié)也沒有明確描述。為了幫助微生物檢驗(yàn)人員更好地理解2016版標(biāo)準(zhǔn)的變化，對(duì)2016版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解讀。

1 范圍

2016版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)?！?2014年8月6日國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公布的《可用于食品的菌種名單》中，還有乳球菌屬和片球菌屬?，F(xiàn)在許多乳品生產(chǎn)企業(yè)在發(fā)酵乳產(chǎn)品中添加了這些球菌。因此，采用2016版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)酵乳制品的乳酸菌檢驗(yàn)時(shí)，無法避免這兩類球菌造成的干擾。

2 術(shù)語和定義

2016版標(biāo)準(zhǔn)前言沒有說明修改了乳酸菌的定義。在這個(gè)部分的修訂，僅僅是將原來的鏈球菌屬修改為嗜熱鏈球菌屬。但是，這是一個(gè)典型的技術(shù)性錯(cuò)誤，嗜熱鏈球菌（Streptococcus Thermophilus）僅僅是鏈球菌屬中的一個(gè)種。這個(gè)部分最大的問題，在于定義的乳酸菌僅限于三個(gè)屬，與國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公布的《可用于食品的菌種名單》中覆蓋的菌種不符，必將對(duì)生產(chǎn)企業(yè)和微生物實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際工作造成更多的困擾。

3 設(shè)備和材料

2016版標(biāo)準(zhǔn)將天平的感量由0.1 g修改為0.01 g，主要是為了保證對(duì)于那些活菌菌種制品的稱量準(zhǔn)確性。但是遺漏了“厭氧裝置、恒溫水浴、漩渦混合儀、顯微鏡、微生物抽濾裝置”等設(shè)備，尤其是厭氧裝置是至關(guān)重要的設(shè)備。恒溫水浴主要為了準(zhǔn)確控制傾注瓊脂的溫度或用于解凍冰凍樣品。

4 培養(yǎng)基和試劑

除了將莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS培養(yǎng)基修改為莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）和半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培養(yǎng)基外，前言部分沒有說明這個(gè)章節(jié)還有其他變化。2016版標(biāo)準(zhǔn)增加了生理鹽水作為稀釋液。而微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的磷酸鹽稀釋液，有可能減少乳酸菌復(fù)蘇數(shù)量[3]，日常工作應(yīng)避免使用。這個(gè)部分遺漏的培養(yǎng)基和試劑，包括棉籽糖發(fā)酵管、菊糖發(fā)酵管、馬尿酸生化管等。而“4.13莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純”和新增的“4.14 半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度＞99%”這兩種試劑僅僅在附錄A的培養(yǎng)基及試劑章節(jié)出現(xiàn)，所以應(yīng)該放在附錄部分直接規(guī)定即可。

5 檢驗(yàn)程序

雖然前言部分沒有專門說明，但是2016版標(biāo)準(zhǔn)中，圖1乳酸菌檢驗(yàn)程序圖有較多的修改。主要變化是修改了樣品稀釋液的接種方法和接種量、修改了培養(yǎng)基而且規(guī)定培養(yǎng)基添加量為15 ml、培養(yǎng)時(shí)間一律從48 h修改為72 h。另外一個(gè)明顯的修改，就是將菌種鑒定明確為“可選做”。

6 操作步驟

6.1 樣品制備

6.1.1和6.1.2分別對(duì)于無菌操作和冷凍樣品的解凍方式進(jìn)行規(guī)定。但是無菌操作這樣的基本常識(shí)，應(yīng)該是在GB 4789.1《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》中規(guī)定[4]。這個(gè)章節(jié)的技術(shù)問題，主要是對(duì)于無菌稀釋液和均質(zhì)方式?jīng)]有詳細(xì)規(guī)定，導(dǎo)致有些實(shí)驗(yàn)室忽視稀釋液的含氧量并使用旋轉(zhuǎn)刀片均質(zhì)器處理樣品，既容易將鏈球菌、乳桿菌、雙歧桿菌常常形成的長(zhǎng)鏈切斷，造成菌數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果偏高，也可能因?yàn)檫@樣的均質(zhì)方式增加了稀釋液里面的氧含量，降低了厭氧菌的生存能力。所以，這個(gè)部分應(yīng)明確使用拍擊式均質(zhì)器及均質(zhì)袋，并且按照GB 4789.28-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》中的規(guī)定[5]，預(yù)先煮沸并迅速冷卻來降低無菌稀釋液中的氧含量，再用于樣品的稀釋。對(duì)于液體樣品，明確規(guī)定采用充分振搖的方式進(jìn)行樣品稀釋，與使用均質(zhì)器均質(zhì)的效果差別很大，所以，執(zhí)行2016版標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)注意。

6.2 步驟

梯度稀釋時(shí)，使用規(guī)格18 mm×180 mm（2.6）這樣較為粗大的無菌試管，有利于樣品稀釋液的混勻，否則在小試管里面很難充分混勻。標(biāo)準(zhǔn)中沒有描述到的實(shí)驗(yàn)室常用儀器，還有漩渦混合儀。主要是反復(fù)吹打方式混勻樣品稀釋液，容易增加稀釋液含氧量和微生物污染機(jī)會(huì)，用漩渦混合儀可以保證樣品稀釋液的均勻，減少污染。

2016版標(biāo)準(zhǔn)中這個(gè)部分技術(shù)性變化最多。乳酸菌計(jì)數(shù)部分，增加了一個(gè)表，分別描述了培養(yǎng)條件及結(jié)果說明?？傮w來說，現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)的做法，就是乳酸菌總數(shù)采用加法計(jì)算代替了原來的減法計(jì)算。其他的變化，除了改用莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）和半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培養(yǎng)基外，還將原來每皿0.1 ml接種量表面涂布修改為每皿1 ml傾注瓊脂、明確規(guī)定平皿中培養(yǎng)基的使用量約15 ml、培養(yǎng)的時(shí)間由48 h延長(zhǎng)至72 h。這些修改，主要依據(jù)ISO 8261、ISO 7889等ISO標(biāo)準(zhǔn)和這一次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)整合的SN/T 1941.1-2007《進(jìn)出口食品中乳酸菌檢驗(yàn)方法 第1部分：分離與計(jì)數(shù)方法》中的做法[6-8]。全球公認(rèn)添加半胱氨酸鹽酸鹽，可以提高雙歧桿菌的耐受性。目前美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)的乳酸菌檢驗(yàn)方法還采用表面涂布0.1 ml[3]，雖然有利于菌落觀察和挑取，但是傾注法的乳酸菌復(fù)蘇更好。此處的技術(shù)性問題，是培養(yǎng)基使用量應(yīng)為20 ml以上，才能符合GB 4789.28-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》對(duì)于培養(yǎng)時(shí)間超過48 h的培養(yǎng)基應(yīng)傾注4 mm左右的厚度和20 ml以上量的強(qiáng)制性規(guī)定[5]。另外，關(guān)于嗜熱鏈球菌的操作，建議實(shí)驗(yàn)室在“將冷卻至48 ℃的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15 ml，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻”時(shí)，應(yīng)明確“將冷卻至48℃的MC培養(yǎng)基趁熱搖勻，使碳酸鈣沉淀充分懸浮后傾注入平皿不少于20 ml，立即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻，放置水平面等待凝固”。只有這樣操作，才可以保證最后觀察到乳酸菌菌落在不透明平板上形成的碳酸鈣透明溶解圈。同時(shí)，對(duì)于嗜熱鏈球菌一般觀察的應(yīng)該是“深”紅色小菌落，以區(qū)別乳桿菌屬偶爾形成的菌落干擾。另外，規(guī)定“從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成”，實(shí)際是從樣品稀釋到“將平板放在厭氧環(huán)境內(nèi)倒置”應(yīng)在15 min內(nèi)完成，否則厭氧菌還是很容易死亡。有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以在厭氧工作站中進(jìn)行這些步驟，可以獲得更準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果。

因?yàn)檫@個(gè)部分的三種培養(yǎng)方法都是要求“培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)”，所以，這個(gè)條款的主要難點(diǎn)在于如何根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)乳酸菌和干擾菌，避免標(biāo)準(zhǔn)定義之外的其他微生物形成菌落造成干擾，因?yàn)楦鞣N微生物單從菌落外觀進(jìn)行區(qū)別判定難度太大，需要實(shí)驗(yàn)室制定作業(yè)指導(dǎo)書來規(guī)定。

6.3 菌落計(jì)數(shù)

這個(gè)部分基本沒有修改。與GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》基本一致[9]，實(shí)驗(yàn)室不容易理解錯(cuò)誤。

6.4 結(jié)果的表述

2010版本的這個(gè)部分，描述為“計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克或每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果?！币?yàn)榧訕恿繛?.1 ml，所以單單直接乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，明顯比實(shí)際值低了10倍。2016版標(biāo)準(zhǔn)將加樣量修改為1 ml后，這個(gè)計(jì)算問題也隨之迎刃而解了。

6.5 菌落數(shù)的報(bào)告

這個(gè)部分沒有修改。

7 結(jié)果與報(bào)告

這個(gè)部分沒有修改。

8 乳酸菌的鑒定（可選做）

這個(gè)部分基本沒有修改。2016版標(biāo)準(zhǔn)中還是沒有加入其他食品微生物檢驗(yàn)方法系列標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用的全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)和生化鑒定試劑盒，需要靠手工生化實(shí)驗(yàn)來鑒定。這個(gè)條款的主要問題是沒有覆蓋目前批準(zhǔn)用于食品生產(chǎn)的乳酸菌菌種，以及如何區(qū)分乳球菌、片球菌。表2中“棉子糖”與GB 4789.34-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》表1描述的“棉籽糖”名詞不一致[10]。

9 附錄A 培養(yǎng)基及試劑

2016版標(biāo)準(zhǔn)中，增加了生理鹽水配方。但是A.1.1 成分中遺漏了蒸餾水1 000 ml，而且滅菌時(shí)間與其他GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)中生理鹽水的滅菌時(shí)間均為15 min不同。A.3.3規(guī)定的“用帶有0.22 mm微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備加入到熔化瓊脂中”，屬于重復(fù)描述，因?yàn)樵贏.3.1和A.3.2已經(jīng)確定了兩種溶液都是過濾除菌的。關(guān)于MC培養(yǎng)基的制法，因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基有平皿傾注和表面接種兩種使用方式，故應(yīng)在A.4.2“分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min”之后，加上“使用時(shí)，融化瓊脂，冷卻至48 ℃左右，趁熱充分搖勻瓊脂，立即傾注平皿，置水平面待瓊脂凝固”。這樣才可以保證其中的碳酸鈣均勻分布在培養(yǎng)基中，發(fā)揮中和細(xì)菌產(chǎn)酸并形成可辨識(shí)的透明溶解圈的作用。A.5 乳酸桿菌糖發(fā)酵管這個(gè)名稱有點(diǎn)兒?jiǎn)栴}。2016版標(biāo)準(zhǔn)中沒有乳酸桿菌這個(gè)定義，按照正文中，應(yīng)該是乳酸菌發(fā)酵管，因?yàn)榭捎糜谌闂U菌和嗜熱鏈球菌的生化實(shí)驗(yàn)。另外，使用121 ℃高壓滅菌15 min～20 min這個(gè)做法也值得商榷，多數(shù)的糖類都不耐高壓，容易導(dǎo)致假陽性。缺少馬尿酸生化管的配方和制法，因?yàn)檫@個(gè)物質(zhì)不屬于糖類。其余部分沒有技術(shù)性修改，僅僅是將原來列在成分條款的pH放在制法條款描述了。

[1] GB 4789．35-2016． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)[S]． 2016．

[2] GB 4789．35-2010． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)[S]． 2010．

[3] 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心譯． 乳品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法[M]． 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：257-259．

[4] GB 4789．1-2016． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則[S]．2016．

[5] GB 4789．28-2013． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S]． 2013．

[6] ISO 8261：2001． Milk and milk products-General guidance for the preparation of test samples，initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination[S]． 2001．

[7] ISO 7889：2003． Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at 37℃[S]． 2003．

[8] SN/T 1941．1-2007． 進(jìn)出口食品中乳酸菌檢驗(yàn)方法 第1部分：分離與計(jì)數(shù)方法[S]． 2007．

[9] GB 4789．2-2016． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S]． 2016．

[10] GB 4789．34-2016． 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)[S]． 2016．

Interpretation for GB 4789.35-2016 Examination of Lactic Acid Bacteria

MA Qunfei Laboratory of Hygienic Microbiology, Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou Fujian 350001, China

GB 4789.35-2016 National Food Safety Standard- Food Microbiological Examination: Lactic Acid Bacteria was analyzed and interpreted. By analyzing the scope, terms and definitions, equipment and materials, media and reagents, inspection procedures, operating procedures, results and reports, identification of lactic acid bacteria, medium and reagents, the basis of the standard change and the existing problems were discussed, and the technical suggestions for the correct application of the standard in food microbiology laboratory were put forward.

national standard; food safety; lactic acid bacteria; examination

R155

A

1674-9316（2017）16-0001-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．16．001

福建省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)科，福建 福州350001