張 梅,于英君(審校)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱150040)

基因治療中重組腺相關(guān)病毒載體的安全性

張 梅,于英君*(審校)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱150040)

基因治療對(duì)常用治療方法難以解決的單基因疾病、癌癥、心血管疾病等往往具有良好的療效。迄今為止，已有超過(guò)2000例的基因治療應(yīng)用于臨床試驗(yàn)[1]，在基因治療臨床試驗(yàn)中超過(guò)68%是應(yīng)用病毒載體。腺相關(guān)病毒(AAV)載體由于其基因傳遞效率高，缺乏致病性和具有良好的安全性而備受青睞[2]。三十多年來(lái)，許多應(yīng)用AAV的基因治療臨床試驗(yàn)取得了成功，rAAV成為人類(lèi)臨床試驗(yàn)的最佳載體之一[3,4,5]，但是我們?nèi)匀徊荒芎鲆暬蛑委煹陌踩詥?wèn)題。本綜述旨在比較全面地探討針對(duì)rAAV的免疫反應(yīng)、rAAV與載體整合等安全性問(wèn)題。

1 rAAV載體的免疫反應(yīng)

截止到2017年2月，全世界已有173項(xiàng)以rAAV作為基因載體的臨床研究(http://www.abedia.com/wiley/)。在這些臨床前和臨床試驗(yàn)中，免疫反應(yīng)常常影響rAAV的基因治療效果。rAAV的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和衣殼蛋白等都是潛在的抗原[6]。人類(lèi)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)與這些因素相互作用，成為獲得高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和取得長(zhǎng)期治療效果的主要障礙。

1.1 針對(duì)rAAV載體的固有免疫反應(yīng)

研究表明，胞嘧啶脫氨基酶家族的hA3A蛋白為AAV復(fù)制的有效抑制劑[7]。人類(lèi)的hA3A能夠綁定病毒單鏈DNA而干擾其合成。這是目前AAV引起固有免疫的直接證據(jù)。補(bǔ)體在AAV引發(fā)的免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色，結(jié)合補(bǔ)體進(jìn)化也證實(shí)了存在AAV所引起的固有免疫反應(yīng)[8]。在小鼠體內(nèi)，巨噬細(xì)胞在啟動(dòng)AAV介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)中起到非常重要的作用。然而，單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)的hA3A限制了AAV在該類(lèi)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。此外，AAV衣殼蛋白與補(bǔ)體C3結(jié)合可抑制巨噬細(xì)胞激活及巨噬細(xì)胞對(duì)AAV的吞噬[8]。上述原因?qū)е铝薃AV在體內(nèi)很少有固有免疫。盡管如此，固有免疫是引發(fā)獲得性免疫的條件，rAAV引發(fā)的細(xì)胞免疫和體液免疫的存在都說(shuō)明了AAV引起的固有免疫廣泛存在于體內(nèi)。

1.2 針對(duì)rAAV載體的獲得性免疫反應(yīng)

許多研究顯示，早年曾有AAV感染而產(chǎn)生的抗體會(huì)影響后期AAV作為基因治療載體的效果[9,10]。不同血清型的AAV的血清中和抗體陽(yáng)性率是各不相同的。AAV1和AAV2的陽(yáng)性率是最高的，AAV2也是抗體滴度最高的血清型[11]。目前，AAV7、8、9和AAVrh10正成為臨床前研究中常見(jiàn)的血清型[12]。有研究表明，AAV2中和抗體的陽(yáng)性率明顯高于AAV7、8、9 。AAV1抗體陽(yáng)性率大部分情況下高于AAV7、8、9。大多數(shù)攜帶AAV7、8 、9抗體的受試者體內(nèi)有抗AAV2的抗體，卻很少有攜帶AAV2抗體的受試者也有AAV7、8、9抗體[13]。來(lái)自于各種野生AAV感染后產(chǎn)生的循環(huán)免疫球蛋白能夠中和各種血清型的rAAV而抑制基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于同種AAV而言，如果一種AAV給藥方式誘導(dǎo)了長(zhǎng)期有效的體液免疫反應(yīng)，那么即使換成另一種給藥方式也會(huì)影響其應(yīng)用[14]。通過(guò)靜脈注射等血管途徑給藥會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。

有研究顯示，在正常人群中存在針對(duì)衣殼蛋白的特異性記憶性CD8+T細(xì)胞[16]。將從健康志愿者體內(nèi)分離的帶有衣殼蛋白抗體的脾細(xì)胞擴(kuò)增后，60%的脾細(xì)胞針對(duì)AAV2會(huì)出現(xiàn)T細(xì)胞反應(yīng)[17]。體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)rAAV重新暴露衣殼蛋白，這些CD8+T細(xì)胞即被激活，清除攜帶衣殼蛋白表位的MHCⅠ復(fù)合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，這種清除呈現(xiàn)出載體的劑量依賴(lài)性。Martino等建立了小鼠模型來(lái)探索衣殼蛋白特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)基因治療中基因表達(dá)的影響，有直接證據(jù)顯示CD8+T細(xì)胞反應(yīng)清除了小鼠體內(nèi)已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)減少[18]。CD8+T細(xì)胞反應(yīng)也在血友病試驗(yàn)、DMD試驗(yàn)等臨床試驗(yàn)中被觀察到。

在基因治療中，轉(zhuǎn)移基因的蛋白產(chǎn)物是另一種潛在的抗原。但是，與其他病毒載體相比，rAAV的轉(zhuǎn)移基因免疫普遍比較弱。這主要是因?yàn)閞AAV不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)象DC和巨噬細(xì)胞這樣的APC。然而，一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)APC，轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)即被蛋白酶體降解，產(chǎn)生的抗原表位負(fù)載于MHCⅠ分子上，MHCⅠ限制性抗原遞呈最終導(dǎo)致針對(duì)靶細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞毒性反應(yīng)。與被rAAV直接轉(zhuǎn)導(dǎo)相反，APC能夠結(jié)合分泌蛋白或者吞噬轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，把它們直接遞呈給MHCⅡ誘導(dǎo)B細(xì)胞免疫和形成抗體，或者交叉遞呈給MHCⅠ誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫[19]。

2 rAAV載體與宿主染色體的整合

近些年，基因治療過(guò)程中，由載體誘導(dǎo)的致瘤、功能基因斷裂、染色體缺失、重排的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)受到了廣泛的重視。rAAV進(jìn)入細(xì)胞后主要以附加體的形式存在，極少數(shù)整合于染色體。但在構(gòu)建的過(guò)程中因目的基因占據(jù)了rep基因的位置，進(jìn)而缺乏了控制定點(diǎn)整合的能力，導(dǎo)致rAAV以低概率與宿主染色體進(jìn)行同源性非定點(diǎn)整合。rAAV的整合與DNA的修復(fù)密切相關(guān)，例如，rAAV在S期細(xì)胞的整合效率比停滯期細(xì)胞高200倍，DNA損傷刺激也能提高rAAV整合效率[20]。rAAV全基因組發(fā)生部分降解和在整合前宿主染色體存在缺口是整合發(fā)生的條件。

rAAV的隨機(jī)整合如果發(fā)生在基因編碼區(qū)，就可能發(fā)生癌基因激活或者抑癌基因失活，增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。近些年有臨床前實(shí)驗(yàn)報(bào)道顯示，應(yīng)用能整合Rian位點(diǎn)相關(guān)的ssAAV進(jìn)行基因傳遞后，出現(xiàn)了肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生率增加的情況[21]。這些研究和逆轉(zhuǎn)錄病毒因整合引起的臨床致癌案例，使rAAV是一種安全的基因治療載體的“信仰”受到了挑戰(zhàn)。Rosas等試驗(yàn)了各種可能促進(jìn)rAAV整合的情況。當(dāng)在經(jīng)rAAV給藥的β-葡萄糖醛酸酶缺乏的新生小鼠體內(nèi)查出癌癥時(shí)，rAAV介導(dǎo)的基因治療能夠致癌已經(jīng)不僅僅是理論上的擔(dān)憂了[22,23]。多年建立的經(jīng)rAAV給藥的人類(lèi)和動(dòng)物的令人鼓舞的安全性數(shù)據(jù)表明，人類(lèi)患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)不能通過(guò)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)性研究中，一些變量潛在影響了癌癥發(fā)生率，這些變量大多數(shù)是嚙齒動(dòng)物的性別、年齡；轉(zhuǎn)基因序列和啟動(dòng)子選擇；載體血清型、劑量和給藥途徑；遺傳背景和生活環(huán)境。總之，病毒整合將帶來(lái)一些危險(xiǎn)似乎合乎邏輯，但研究連續(xù)表明這種危險(xiǎn)性相對(duì)較低，尋找“安全”整合位點(diǎn)，控制整合頻率是未來(lái)的研究方向之一。

3 展望

盡管針對(duì)rAAV的免疫反應(yīng)及其隨機(jī)整合導(dǎo)致的安全問(wèn)題令其基因治療遭遇重重阻礙，但是近年來(lái)rAAV對(duì)癌癥、糖尿病等多種頑疾的療效有目共睹。因此，通過(guò)減少rAAV的免疫反應(yīng)、提高靶向性及發(fā)現(xiàn)定點(diǎn)整合安全位點(diǎn)等方式來(lái)提高rAAV的安全性是今后研究工作重點(diǎn)，克服上述瓶頸將使rAAV能夠更加廣泛地應(yīng)用于基因治療。

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黑龍江省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(ZHY16-088)

1007-4287(2017)04-0751-03

張梅(1977-)，女，碩士，講師，主要從事中藥抗腫瘤及腫瘤基因治療；于英君(1953-)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗腫瘤及腫瘤基因治療.

2016-12-06)

*通訊作者