李紅巖，尹宗濤，趙科研

(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽(yáng)110840)

硫化氫對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肥大細(xì)胞及IL-6的影響

李紅巖，尹宗濤，趙科研*

(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽(yáng)110840)

目的 探討硫化氫對(duì)野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓(PH)大鼠肥大細(xì)胞及IL-6的影響。方法 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為MCT組、H2S組和control組，每組8只。MCT組：野百合堿60 mg/kg一次性腹腔注射；H2S組野百合堿60 mg/kg一次注射，并且每天腹腔注射N(xiāo)aHS(56 μmol/kg) 1 ml；control組分別注射等量生理鹽水。3周后測(cè)定大鼠肺動(dòng)脈平均壓力(mPAP)、右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]；甲苯胺藍(lán)染色測(cè)定大鼠肺組織切片中肥大細(xì)胞數(shù)量及脫顆粒肥大細(xì)胞比例；檢測(cè)大鼠血漿中IL-6及H2S的含量。 結(jié)果 3周后，MCT組大鼠肺動(dòng)脈平均壓力、右心肥厚指數(shù)明顯高于control組(P<0．05)，肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞比例明顯升高，血漿IL-6升高，而H2S降低。而H2S組能明顯抑制肺動(dòng)脈平均壓力增高及右心肥厚指數(shù)的增加，肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)較MCT組降低(單位：n/10 mm2，12.14±3.72 比24.67 ±4.46，P<0.05)；脫顆粒肥大細(xì)胞比例降低[(29.31±6.71)% 比(52.15±9.65)%，P<0.05]；同時(shí)H2S組與MCT組相比，血漿中IL-6降低，H2S升高，P<0.05。結(jié)論 硫化氫可能通過(guò)抑制肥大細(xì)胞聚集、脫顆粒，以及抑制IL-6的釋放抑制肺動(dòng)脈高壓形成。

硫化氫；野百合堿；肺動(dòng)脈高壓；肥大細(xì)胞；白介素-6

(ChinJLabDiagn,2017,21:0689)

肺動(dòng)脈高壓(PH)是臨床中常見(jiàn)且嚴(yán)重危害生命健康的心血管疾病之一，有研究表明肥大細(xì)胞在肺高壓的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色[1],肥大細(xì)胞可以釋放IL-6等炎癥因子，而且IL-6已經(jīng)被證實(shí)在PH動(dòng)物模型中發(fā)揮重要作用[2]。而硫化氫(H2S)是繼一氧化氮及一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，具有舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用[3],亦具有一定的抗炎作用[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)野百合堿腹腔注射建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，并預(yù)防性給予H2S干預(yù)，觀察干預(yù)后肺動(dòng)脈高壓是否受到抑制，及干預(yù)后肺組織肥大細(xì)胞及血漿中IL-6的變化，為肺動(dòng)脈高壓提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體重160-220 g，周齡7周，購(gòu)自沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法分為control組、MCT組及H2S組，每組8只。MCT組及H2S組：野百合堿60 mg/kg劑量一次性腹腔注射后飼養(yǎng)3周，control組注射等量的生理鹽水，相同條件下飼養(yǎng)。H2S組大鼠于注射野百合堿的當(dāng)天予以腹腔注射N(xiāo)aHS(56μmol/kg)，連續(xù)給予3周，MCT組和control組每天給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水，同等條件下飼養(yǎng)3周。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 參照孫波[5]方法測(cè)定肺動(dòng)脈平均壓力(mPAP:mean pulmonary arterial press)。飼養(yǎng)3周后，大鼠稱(chēng)體重，10%水合氯醛 35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于小動(dòng)物解剖臺(tái)上。消毒頸部皮膚，作頸部正中偏右縱向切口2 cm，分離皮下，顯露并游離右頸外靜脈1 cm，在其下面穿入兩根2/0手術(shù)絲線(xiàn)，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端活結(jié)準(zhǔn)備，將微導(dǎo)管預(yù)充肝素生理鹽水(防止管腔內(nèi)存在氣泡)后連接三通管再經(jīng)換能器連接于BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)零，肝素鹽水潤(rùn)管。于右頸外靜脈近端作一斜切口，將微導(dǎo)管插入右頸外靜脈中，將近端活結(jié)系緊以固定微導(dǎo)管，通過(guò)BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定并記錄肺動(dòng)脈平均壓力。

1.2.3 右心室肥厚指數(shù)的檢測(cè) mPAP測(cè)定之后，正中開(kāi)胸，完整切下大鼠心臟，沿房室溝剪除心房組織，分別剪取右心室(RV)和左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去血液后稱(chēng)重，計(jì)算RV/(LV+S) [右心室/(室間隔十左心室)]值,以此作為右心室肥大的指標(biāo)。

1.2.4 組織固定及染色 自胸腔取出肺組織,分離后用10%中性甲醛經(jīng)氣管緩慢注入大鼠肺內(nèi),使肺平滑膨脹；同時(shí)經(jīng)肺動(dòng)脈用生理鹽水灌洗肺，5分鐘后將右下肺浸泡于10%中性甲醛中固定。1周后在左右肺的矢狀切面各取組織兩塊,常規(guī)脫水,石蠟包埋，肥大細(xì)胞染色，測(cè)定各組大鼠肺組織甲苯胺藍(lán)染色切片中肥大細(xì)胞數(shù)量及肺血管周?chē)擃w粒肥大細(xì)胞比例。

1.2.5 血漿內(nèi)皮素IL-6檢測(cè)(ELISA法) 大鼠處死前腹主動(dòng)脈抽血離心保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明步驟，檢測(cè)大鼠血漿中IL-6的含量。

1.2.6 血漿H2S測(cè)定 采用去蛋白方法[6]，首先在玻璃試管中加入0.5 ml 10 g/L醋酸鋅，然后加入0.1 ml血漿標(biāo)本，振蕩混勻，再依次加入20 mmol/L對(duì)苯二胺鹽酸鹽和30 mmol/L三氯化鐵各0.5 ml，室溫孵育20 min，再加入10%三氯醋酸1 ml使蛋白沉淀，加2.5 ml蒸餾水補(bǔ)足體積至5 ml，充分混勻，6 000 轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，吸出上清液，用酶標(biāo)儀在670 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，依據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算血漿中H2S的含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

3周后，對(duì)照組皮毛光澤，呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)靈活，體重明顯增加，無(wú)死亡；MCT組大鼠出現(xiàn)皮毛枯槁、松毛、無(wú)光澤，呼吸急促、肝腫大、活動(dòng)減少、飲食減少等表現(xiàn)，死亡2只，死亡率為25%；而H2S組食欲可，體質(zhì)量增加，呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)良好，死亡1例，死亡率12.5%。

2.2 control組、MCT組及H2S組各指標(biāo)檢測(cè)比較

結(jié)果見(jiàn)表1。各組大鼠mPAP組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，與對(duì)照組相比，MCT組mPAP顯著升高，差異顯著(P<0．05)，H2S組大鼠mPAP較MCT組下降，差異顯著(P<0．05)。大鼠右心肥厚指數(shù)組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MCT組右心肥厚指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0．05)，H2S組右心肥厚指數(shù)較MCT組降低，差異明顯(P<0.05)。肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，與對(duì)照組大鼠相比，MCT組大鼠肺組織中肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增高，差異顯著(P<0.05)；與MCT組大鼠相比，H2S組大鼠肺內(nèi)的肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，差異明顯(P<0.05)。與對(duì)照組大鼠相比，MCT組大鼠肺組織中脫顆粒肥大細(xì)胞比例明顯增高，差異顯著(P<0.05)；與MCT組大鼠相比，H2S組大鼠肺內(nèi)的脫顆粒肥大細(xì)胞的比例明顯下降，差異顯著(P<0.05)。大鼠血漿中IL-6平均濃度值組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。MCT組血漿中IL-6含量顯著高于對(duì)照組(P<0．05)，H2S組大鼠血漿中IL-6含量較MCT組降低，差異顯著(P<0．05)。血漿H2S含量組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。與對(duì)照組比較，MCT組大鼠血漿H2S含量降低，P<0.05；與MCT組比較，H2S組大鼠血漿H2S含量明顯增高，P<0.05。

表 各組測(cè)量結(jié)果

注：mPAP:mean pulmonary arterial press,RV/LV+VS:right ventricle/left ventricle + septum。與對(duì)照組比較，*P<0.05，與MCT組比較，#P<0.05

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是一種累及肺動(dòng)脈和右心的嚴(yán)重疾病，肺動(dòng)脈壓力持續(xù)上升為其基本特征，其發(fā)病原因尚未明確，它可以作為一種疾病獨(dú)立存在，然而更多見(jiàn)的是多種心肺疾病進(jìn)展到一定階段的生理表現(xiàn)。PH發(fā)生和發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)是肺血管收縮、肺血管重構(gòu)和肺血管原位血栓形成。野百合堿是一種生物堿，具有細(xì)胞毒性作用，經(jīng)肝臟代謝后的產(chǎn)物——吡咯野百合堿可損傷肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管，使肺動(dòng)脈血管重建、肺血管阻力增加，從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCT組大鼠mPAP、右心室肥厚指數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),我們通過(guò)野百合堿(60 mg/kg)單次腹腔注射誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。

H2S是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的又一新的具有心血管調(diào)節(jié)功能的氣體信號(hào)分子。有研究表明H2S具有擴(kuò)張血管、降低血壓的作用，能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，并且抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[8]，亦具有一定的抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)預(yù)防性使用外源性H2S供體NaHS對(duì)肺高壓大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，MCT組應(yīng)用NaHS干預(yù)后，血漿H2S的濃度明顯升高，mPAP降低了24.98%，右心室肥厚指數(shù)下降了20.4%，表明H2S能夠抑制PH的形成。

Miyata等[9]研究指出，在野百合堿所致的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的肺組織中可見(jiàn)到大量肥大細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，肥大細(xì)胞的聚集對(duì)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展起到了重要作用，而且多數(shù)肥大細(xì)胞以脫顆粒狀態(tài)聚集在血管周邊。Bhola K Dahal[10]等指出之所以肥大細(xì)胞在野百合堿所致的肺高壓模型中出現(xiàn)大量聚集和脫顆?，F(xiàn)象，是由于野百合堿有很強(qiáng)的毒性作用，進(jìn)而引起肺組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和肺血管的損傷，導(dǎo)致肺血管壓力以及阻力的增加。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Miyata和Dahal等人的研究，在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺組織切片中可以觀測(cè)到大量的肥大細(xì)胞，結(jié)果顯示，MCT組大鼠肺組織中肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多，較對(duì)照組升高了79.21%(P<0.05)，其中脫顆粒肥大細(xì)胞比例較對(duì)照組升高了76.55%(P<0.05)。給予外源性硫化氫供體硫氫化鈉對(duì)肺高壓大鼠進(jìn)行干預(yù)之后，大鼠血漿中H2S的濃度升高顯著，肺組織中肥大細(xì)胞數(shù)量和脫顆粒肥大細(xì)胞的比例明顯下降，說(shuō)明了H2S對(duì)肥大細(xì)胞的聚集和脫顆粒有抑制作用。

肥大細(xì)胞被激活后能夠產(chǎn)生IL-6、IL-13等炎癥因子，這些介質(zhì)在PH的發(fā)病機(jī)制和肺血管重構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用[11,12]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠血漿中IL-6的含量，結(jié)果顯示，MCT誘導(dǎo)的肺高壓模型中血漿IL-6含量明顯升高，H2S組大鼠炎癥因子IL-6的表達(dá)較MCT組明顯減少，說(shuō)明硫化氫能夠抑制IL-6的釋放。提示H2S可能通過(guò)抑制肥大細(xì)胞的聚集、脫顆粒以及抑制IL-6的釋放干預(yù)調(diào)節(jié)大鼠肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。

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Effects of hydrogen sulfide on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline

LIHong-yan,YINZong-tao,ZHAOKe-yan.

(DepartmentofCardiovascularSurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryDistrict,Shenyang110840,China)

Objective To study the effects of H2S on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline.Methods A total of 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups including MCT group,H2S group and control group(n=8 respectively).The rats of MCT group and H2S group were injected with a single intraperitoneal monocrotaline (60 mg/kg),and NaHS (56 μmol/kg) was injected into the rats in H2S group everyday,while the other groups saline was done instead.After 3 weeks,the mean pulmonary artery pressure(mPAP) and ratio of right ventricle/(left ventricle +septum) [RV/(LV+S)] of the rats in three groups were measured.The number of mast cell and degranulation was measured by toluidine blue stain.The plasma IL-6 level and the plasma H2S level of the rats were detected.Results After 3 weeks,compared with the control group,the MCT group showed increased mPAP and RV/(LV+S) (P<0.05);Both the number of mast cell and the ratio of degranulateted mast cell increased.The plasma IL-6 level also increased while the plasma H2S level was decreased.Compared with MCT group,both mPAP and RVHI were prevented in the H2S group.And also the number of mast cell decreased (n/10 mm2,12.14±3.72 vers 24.67±4.46，P<0.05),the ratio of degranulateted mast cell were decreased (29.31±6.71% vers 52.15±9.65%,P<0.05).In addition,H2S can lower plasma IL-6 level.Conclusion H2S probably can ameliorate PH by inhibiting accumulation and degranulation of mast cell and restraining the release of IL-6.

Hydrogen sulfide;Monocrotaline;Pulmonary hypertension;Mast cell;Interleukin-6

遼寧省自然科學(xué)基金(2015020421)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2013M542471)

1007-4287(2017)04-0689-04

R544.1+6

A

2016-08-06)

*通訊作者