黃立佳 孫成龍 黃楊 鄒陽(yáng) 王昌興?

細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭壞死發(fā)病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

黃立佳 孫成龍 黃楊 鄒陽(yáng) 王昌興?

目前，臨床上較多免疫性疾病均不能根治，使用類固醇激素延緩病情已成為一種有效手段，但長(zhǎng)期使用激素所帶來(lái)的副作用卻不容忽視，如腎上腺皮質(zhì)功能損害、骨質(zhì)疏松和自發(fā)性骨折等。激素性股骨頭缺血性壞死（Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）可能由長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素引起，最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，SANFH占所有骨壞死病例的24.1%［1］。研究表明在激素性股骨頭壞死中存在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞凋亡［2］，這表明骨細(xì)胞凋亡是SANFH病程發(fā)展中的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本文對(duì)目前SANFH中骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因及細(xì)胞因子研究成果作一綜述。

1 激素性股骨頭壞死中骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

1.1 Bcl-2家族 在Bcl-2家族中，Mcl-1、Bcl-w、Bcl-xL及Bcl-2具有抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)的作用，其機(jī)制為［3］：（1）鈣離子在細(xì)胞凋亡中起到重要作用，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Bcl-2 可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，故可以起到抗凋亡的作用。（2）Bcl-2可以通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生從而抗凋亡。（3）Bcl-2在線粒體膜上定位固定凋亡蛋白前體（Apaf-1），從而使Apaf-1不能激活凋亡信號(hào)。而大劑量的激素抑制Bcl-2的表達(dá)，使凋亡信號(hào)激活且不受抑制。

相關(guān)研究表明，作為抑制和促進(jìn)凋亡的Bcl家族的兩種典型蛋白質(zhì)，Bcl-2和Bax在調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，線粒體功能和細(xì)胞色素C（Cyt-c）釋放的作用中起關(guān)鍵作用，Bcl-2和Bcl-xL可以抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開(kāi)放，而避免因Bax導(dǎo)致PTP開(kāi)放所引起的外基質(zhì)內(nèi)流，線粒體腫脹破壞從而細(xì)胞凋亡，Bcl-2可以阻斷線粒體釋放Cyt-c，細(xì)胞是否對(duì)凋亡信號(hào)發(fā)生反應(yīng)較大程度上取決于Bax / Bcl-2的比值，當(dāng)Bax / Bcl-2比值大于正常時(shí)，細(xì)胞易發(fā)生凋亡，當(dāng)比值小于正常時(shí)，凋亡則被抑制，然而大劑量的激素抑制了Bcl-2的表達(dá)，使細(xì)胞易凋亡［4］。Zhang等［5］研究發(fā)現(xiàn)在激素性股骨頭壞死細(xì)胞凋亡中，通過(guò)抑制 Bcl-2的減少和Bax的增加，抑制骨細(xì)胞的凋亡和股骨頭壞死的惡化。有研究報(bào)道，隨著SANFH病程的發(fā)展，Bcl-2的表達(dá)水平逐漸下降［6］。1.2 Fas/FasL 系統(tǒng) Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，F(xiàn)as（也稱為CD95或APO-1或TNFRSF6）是 I 型跨膜糖蛋白，在其細(xì)胞質(zhì)區(qū)域含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD），這對(duì)于凋亡的誘導(dǎo)是必需的。Fas 的配體 FasL，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在活化 T 細(xì)胞膜上表達(dá)。Fas 和FasL屬于TNF家族成員，凋亡的誘導(dǎo)由Fas與其配體FasL的相互作用觸發(fā)，F(xiàn)asL是允許銜接蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（FADD）募集和procaspase-8結(jié)合的 40kDa膜蛋白［7］，F(xiàn)as 和 FasL結(jié)合形成一種活性形式三聚體，傳遞凋亡信息，誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行［8］。Thaler等［9］報(bào)道稱，使用蘿卜硫烷上調(diào)小鼠骨細(xì)胞內(nèi)Fas的表達(dá)，并誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞的凋亡。Martin 等［10］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn) MLO-Y4 骨細(xì)胞用地塞米松處理后出現(xiàn) FasmRNA 表達(dá)增加，并導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡。

1.3 p53基因 P53與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，p53通過(guò)控制增殖細(xì)胞由細(xì)胞周期G1向S移行的控制點(diǎn)參與細(xì)胞周期調(diào)控。其具有強(qiáng)迫DNA損傷的細(xì)胞停滯在G1期并進(jìn)行DNA修復(fù)。如DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其凋亡。p53已被證明能導(dǎo)致線粒體功能障礙，且能通過(guò)多種信號(hào)通路激活caspase家族，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［11］。Ou等［12］研究發(fā)現(xiàn)FAK-P53-MDM2信號(hào)回路在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中起重要作用，F(xiàn)AK和MDM2是腫瘤基因，F(xiàn)AK是p53的負(fù)調(diào)節(jié)物，通過(guò)敲除FAK和MDM2基因，p53基因得到活化，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡及抗增殖效應(yīng)。Okuma等［13］在缺血/再灌注誘導(dǎo)的特發(fā)性骨壞死模型中，觀察到p53的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)MLO-A5前成骨細(xì)胞的凋亡，且利用p53抑制劑改善這種情況。Sui等［14］在大劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型中應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到與對(duì)照組比較BMSC凋亡增加，且p53表達(dá)增加。

1.4 Caspase家族 有研究表明Caspase與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)總共14個(gè)家族成員，且可以分為兩類：一個(gè)涉及其他Caspase家族成員的激活，包括Caspase- 1，2，4，5，8，9和10；另一種是主要介導(dǎo)凋亡的執(zhí)行期，包括Caspase-3，6，7，14。其中Caspase-3是Caspase家族中發(fā)揮作用的主要形式，是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，是關(guān)鍵酶和凋亡的執(zhí)行者［15］。凋亡由線粒體外膜的完整性喪失，細(xì)胞凋亡蛋白如Cyt-C的釋放，然后激活Caspase-3，通過(guò)Fas / FasL或Bax / Bcl-2途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［16］。賈巖波等［17］發(fā)現(xiàn)在激素性股骨頭壞死早期細(xì)胞凋亡中，Caspase-3表達(dá)顯著增高，且可通過(guò)藥物抑制Caspase-3的表達(dá)而減少骨細(xì)胞的凋亡。這表明Caspase-3與激素性股骨頭壞死早期細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Xu等［18］2014年報(bào)道在激素性股骨頭壞死中，STAT1-Caspase-3通路在激素性股骨頭壞死中起到重要作用，Caspase-3的上調(diào)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要因素。

1.5 血紅素氧合酶-1 近期研究表明，血紅素氧合酶-1（heme oxygenases HO-1）具有抗氧化、抗凋亡及在缺血缺氧情況下保護(hù)細(xì)胞的功能［19］。作為細(xì)胞保護(hù)酶，HO-1催化血紅素降解中的限速步驟，并產(chǎn)生三種最終副產(chǎn)物，包括膽紅素、CO及鐵離子。膽紅素是由膽綠素和膽綠素還原酶反應(yīng)產(chǎn)生，是消除脂質(zhì)過(guò)氧化物有效的自由基清除劑，CO可以減弱一些氧合酶的催化活性，并抑制過(guò)量的NO產(chǎn)生［20］。李杰等［21］利用質(zhì)粒將HO-1轉(zhuǎn)染進(jìn)入成骨細(xì)胞中，乙醇干預(yù)24h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示HO-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯減低，這表明轉(zhuǎn)染HO-1能抑制乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Sato等［22］發(fā)現(xiàn)在缺血性股骨頭壞死疾病進(jìn)展中存在細(xì)胞凋亡，且與HO-1mRNA表達(dá)有存在相關(guān)性，在創(chuàng)傷后3h在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中檢出凋亡相關(guān)基因HO-1mRNA的表達(dá)，在6h時(shí)出現(xiàn)組織學(xué)改變，表現(xiàn)為骨骺處活躍成骨細(xì)胞的死亡，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，24h時(shí)在骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中觀察到凋亡小體，在3～24h內(nèi)HO-1mRNA持續(xù)表達(dá)，在24h后HO-1mRNA表達(dá)逐漸減少或消失。但目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道HO-1是否參與激素性股骨頭壞死細(xì)胞凋亡進(jìn)程，有待后續(xù)研究。

2 激素性股骨頭壞死中骨細(xì)胞凋亡相關(guān)細(xì)胞因子

2.1 低氧誘導(dǎo)因子1α 低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia －inducible factor-1 alpha，HIF-1α）在細(xì)胞缺血缺氧時(shí)產(chǎn)生保護(hù)作用，在正常氧含量情況下，HIF-1α活性受到氧依賴性羥化酶－缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH）及脯氨酰羥化酶（prolyl－h(huán)ydroxy-lases，PHDs）的一系列調(diào)控，從而羥基化被抑制，細(xì)胞缺氧時(shí)，F(xiàn)IH和PHDs的活性受到抑制，HIF-1α的活性增高，缺氧時(shí)可誘導(dǎo)HIF -1α進(jìn)入細(xì)胞核，與HIF - 1β結(jié)合形成HIF - 1，提高共激活因子CBP/ P300，反式激活下游靶基因，包括纖溶酶原激活物抑制劑1型，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及fm-樣酪氨酸激酶1等，導(dǎo)致細(xì)胞一系列功能改變，如血管發(fā)生，能量代謝等，使其對(duì)缺氧環(huán)境產(chǎn)生耐受［23］。He等［24］報(bào)道HIF - 1α在缺氧時(shí)可通過(guò)多種信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的保護(hù)。

缺血缺氧是激素性股骨頭壞死發(fā)病的關(guān)鍵因素，趙振群等［25］研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在激素性股骨頭缺血壞死早期呈現(xiàn)低表達(dá)，且與骨細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)。Fan等［26］在激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型中使用PHDs抑制劑EDHB抑了HIF-1α的降解，激活HIF-1信號(hào)通路促進(jìn)血管生成，降低空骨陷窩率，減少細(xì)胞凋亡。至今，對(duì)于激素如何抑制HIF-1α的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道，未來(lái)可作進(jìn)一步的研究。

2.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種同源二聚體糖蛋白，活化的VEGF能促進(jìn)新血管的生成，紅細(xì)胞生成及細(xì)胞的增殖和生存，而VEGF-165不僅在VEGF家族中活性最高，且分布范圍之廣，是發(fā)揮作用的主要形式，有研究通過(guò)建立急性放射性皮膚損傷模型，分組給予不同血管生長(zhǎng)因子，通過(guò)觀察微循環(huán)和細(xì)胞凋亡的變化比較發(fā)現(xiàn)VEGF-165在抑制細(xì)胞凋亡和預(yù)防損傷進(jìn)展上比其他因子更有效［27］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF參與缺血性股骨頭壞死的病理生理過(guò)程，Zhang等［28］將6周齡Sprague Dawley大鼠股骨頸周圍血管切除制造缺血性股骨頭壞死模型，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR研究分析軟骨細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示，在24h內(nèi)，常氧條件下軟骨細(xì)胞中的VEGF水平顯著高于缺氧條件下的含量；72h后，缺氧條件下的軟骨細(xì)胞中的VEGF水平增加并且顯著高于常氧條件下的含量。Wu等［29］應(yīng)用桃紅四物湯促進(jìn)激素性股骨頭壞死模型體內(nèi)VEGF的表達(dá)，并且明顯抑制了成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的凋亡。Hang等［30］應(yīng)用脂質(zhì)體將VEGF-165導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，將自體VEGF-165轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入早期股骨頭壞死模型，12周后觀察到轉(zhuǎn)基因組的骨小梁的規(guī)則布置和明顯的骨再生，且新生毛細(xì)血管數(shù)量與非轉(zhuǎn)基因自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入組比較明顯增加，證明VEGF-165能改善早期股骨頭壞死模型中的骨重建和血管再生，為治療早期股骨頭壞死提供一種好方法。

3 討論

類固醇激素誘發(fā)的股骨頭無(wú)血管性壞死主要好發(fā)于年輕人和老年人，患者一般曾長(zhǎng)期或短期密集使用激素，在多數(shù)患者中，該疾病是雙側(cè)的，且病變面積很廣、致殘率高。目前，激素性股骨頭壞死主要通過(guò)手術(shù)來(lái)治療，包括：髓芯減壓術(shù)、植骨術(shù)、股骨近端截骨術(shù)及人工股骨頭置換術(shù)。

細(xì)胞凋亡是激素性股骨頭壞死的重要病因之一，激素在病程進(jìn)展中，誘導(dǎo)了成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡，減少破骨細(xì)胞的形成，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換的減少，促進(jìn)連續(xù)凋亡。目前通過(guò)干預(yù)相關(guān)重要基因及細(xì)胞因子從而減少骨細(xì)胞凋亡率已成為研究的熱點(diǎn)，但對(duì)于激素如何上調(diào)或下調(diào)凋亡基因及細(xì)胞因子還需做進(jìn)一步的探究，明確激素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，從而可選擇激素致病的最初靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，從源頭降低應(yīng)用激素治療相關(guān)疾病時(shí)股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)，最大程度的保證激素的療效。

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310053浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（黃立佳 孫成龍 黃楊）

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（鄒陽(yáng) 王昌興）

*通信作者