吳廣升 惠光艷

非病毒基因載體的研究進(jìn)展

吳廣升 惠光艷

病毒載體與非病毒載體是目前最常使用的兩大類基因轉(zhuǎn)運載體。雖然病毒載體，如腺病毒、慢病毒等轉(zhuǎn)染效率更高，但由于存在細(xì)胞毒性、潛在致突變性及較高的免疫原性等的安全問題，使其在臨床進(jìn)一步應(yīng)用受到很大的限制。非病毒載體，如天然多糖聚合物、陽離子聚合物、脂質(zhì)體、無機(jī)納米載體等具有結(jié)構(gòu)簡單、制備過程可控、低免疫原性等優(yōu)點。本文主要就非病毒基因載體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

基因；載體；綜述

基因治療是將基因(質(zhì)粒DNA，siRNA及miRNA等)轉(zhuǎn)染入特定細(xì)胞中，通過促進(jìn)或抑制目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而達(dá)到治療人類疾病的目的[1]。由于RNA及DNA基因片段自身帶負(fù)電荷且易被核酸酶降解、很難穿過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，選擇適當(dāng)?shù)幕蜉d體保護(hù)并轉(zhuǎn)運基因片段進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)是急需解決的問題[2]。病毒載體與非病毒載體是最常使用的兩大類基因轉(zhuǎn)運載體。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但免疫原性、致瘤性及難以大量制備等缺點限制了其臨床應(yīng)用。天然多糖聚合物、陽離子聚合物、脂質(zhì)體等非病毒載體具有結(jié)構(gòu)簡單、免疫原性弱等優(yōu)點，是一類非常有應(yīng)用前景的基因載體。

1 天然多糖聚合物

目前天然多糖基因載體以殼聚糖、葡聚糖、環(huán)糊精、甘露聚糖、透明質(zhì)酸等最為常見。多糖由多個重復(fù)的單元、基團(tuán)構(gòu)成，并決定了其溶解度、表面電荷及化學(xué)修飾的難易度等特性，并最終影響轉(zhuǎn)染效率[3]。

1.1 殼聚糖 殼聚糖是甲殼素脫乙酰而形成的天然生物大分子，具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性，可以與帶負(fù)電荷的DNA、siRNA及miRNA等通過靜電吸引方式結(jié)合形成納米聚合物。不僅可以保護(hù)這些基因免受核酸酶的降解，還有利于細(xì)胞對其黏附、吞噬。Wu等[4]以殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質(zhì)酸(CS/TPP/HA)納米粒為載體，觀察此納米粒的粒徑、電位、多分散性及對antimiR-138的包封率等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CS/TPP/HA納米粒不僅可以負(fù)載antimiR-138、保護(hù)其活性不受RNA酶降解，還可以將antimiR-138成功地轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中，促進(jìn)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。Chen等制備了CS/TPP/miR-199a-5p納米粒并轉(zhuǎn)染人骨髓來源的MSCs，可以提高M(jìn)SCs的ALP水平、細(xì)胞基質(zhì)礦化及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，將CS/TPP/miR-199a-5p納米粒轉(zhuǎn)染體系用于大鼠脛骨缺損處，可以顯著提高骨再生的量[5]。

1.2 葡聚糖 葡聚糖，也被稱右旋糖酐，由多個重復(fù)葡萄糖單元構(gòu)成多糖聚合物，具有良好的生物相容性。葡聚糖眾多的羥基基團(tuán)結(jié)構(gòu)易于化學(xué)修飾，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和治療的研究。學(xué)者們經(jīng)常對葡聚糖進(jìn)行一定的改性，利用葡聚糖的衍生物載基因。Thomas等[6]利用縮水甘油基三甲基氯化銨改性葡聚糖并與小牛胸腺DNA(ctDNA)結(jié)合制備出納米粒，降低了DNA表面電荷和直徑；采用瓊脂糖凝膠電泳證實其穩(wěn)定性及保護(hù)DNA不被核酸酶消化。體外采用MTT法檢測葡聚糖基衍生納米粒對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，證實其安全性及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可行性的。

1.3 環(huán)糊精 環(huán)糊精(Cyclodextrin)是一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元，是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對直鏈淀粉進(jìn)行酶解產(chǎn)生的。環(huán)糊精作為天然生物材料，無免疫原性，生物相容性好，引入修飾基對環(huán)糊精的理化性質(zhì)進(jìn)行改性，使其成為靶向的基因載體已成為廣大學(xué)者研究的重點方向之一[7]。用聚乙烯亞胺(PEI)修飾環(huán)糊精可顯著提高轉(zhuǎn)染效率。Hu等[8]將低分子量的PEI連接到環(huán)糊精骨架上負(fù)載miRNA-34a，發(fā)現(xiàn)較單純的環(huán)糊精，環(huán)糊精-PEI載體顯示出更高的轉(zhuǎn)染效率，胰腺癌細(xì)胞被環(huán)糊精-PEI/miRNA-34a納米粒轉(zhuǎn)染后其增殖、遷移能力顯著降低。

1.4 甘露聚糖 甘露聚糖是以甘露糖為單體的高度分枝聚合物，廣泛存在于多種生命形式中。其可來源于魔芋、蘆薈、海藻、酵母等天然產(chǎn)物。Ruan等[9]將精胺連接到甘露聚糖的側(cè)鏈上，接枝率約12%，然后此甘露聚糖-精胺負(fù)載DNA并轉(zhuǎn)染甘露糖受體高表達(dá)的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率為精胺普魯蘭多糖的28.5倍，PEI的11.5倍及脂質(zhì)體2 000的3.0倍。證明該甘露聚糖-精胺轉(zhuǎn)染體系是一個通過巨噬細(xì)胞甘露糖受體介導(dǎo)的穩(wěn)定的特異性轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。

2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系

在體外，脂質(zhì)體是最常用的基因轉(zhuǎn)染試劑之一。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的siRNA、miRNA等核酸結(jié)合，通過包裹核酸，保護(hù)其免受血液中核酸酶的降解，并維持其完整性和生物活性。然而，由于脂質(zhì)體較高的毒性，非特異性細(xì)胞攝取和不必要的免疫反應(yīng)等缺點，很難在體內(nèi)實現(xiàn)安全、有效地應(yīng)用[10]。陽離子脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物表面帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜通過靜電吸附作用結(jié)合，再通過細(xì)胞膜融合將核酸導(dǎo)入細(xì)胞核。目前，常用的幾個商業(yè)化脂質(zhì)體包括RNAifect Transfection(Qiagen)，PORT NeoFX(Applied Biosystems)，Lipofectamine(Invitrogen)等品牌。許多學(xué)者一直致力于改變脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)及應(yīng)用方式，并取得了一些成功[11]。Wu等[12]將Lipofectamine2000/antimiR-138復(fù)合物通過冷凍干燥的方法固定到細(xì)胞培養(yǎng)板(TCPS)的表面，發(fā)現(xiàn)此脂質(zhì)體/antimiR-138復(fù)合體可以以一種完整的近圓球形顆粒的結(jié)構(gòu)附著在培養(yǎng)板表面，可以長期保持miRNA的穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。之后作者又將MSCs接種于該脂質(zhì)體/miRNA涂層表面，證實其可以促進(jìn)MSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)，較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法具有更低的細(xì)胞毒性和更高的轉(zhuǎn)染效率。

3 聚乳酸聚乙醇酸Poly(lactide-co-glycolide)(PLGA)

PLGA聚合物是一類不溶于水的高分子有機(jī)聚合物，具有良好的生物相容性、低毒性及低免疫原性等優(yōu)點[13]。之前很多研究主要關(guān)注PLGA聚合物負(fù)載miRNA效率及非特異轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的過程，近期研究表明PLGA還具有控釋miRNA特點[14]。陽離子聚合物(如PEI、殼聚糖)對PLGA修飾可以穩(wěn)定其表面Zeta電位，增大miRNAs吸附效率[13]。PLGA聚合物可以很容易地接枝其他活性分子并形成微粒和納米顆粒[15]。PLGA納米粒負(fù)載DNA、miRNA、siRNA等核苷酸時，載藥能力高并可以對抗核酸降解。

4 聚乙烯亞胺(Polyethylenei-mine，PEI)

PEI是一種廣泛研究的聚合物基因載體，合成方便、價格低廉。在生理環(huán)境中，由于胺基質(zhì)子化使其帶正電荷，可以和核酸結(jié)合形成聚合物。PEI和核酸酸形成的陽離子復(fù)合物通常保留的凈正電荷，可與細(xì)胞表面帶負(fù)電的糖蛋白和蛋白聚糖等發(fā)生非特異性結(jié)合。一旦該復(fù)合體與細(xì)胞表面結(jié)合，隨后經(jīng)過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿。PEI/核酸聚合體在胞漿內(nèi)釋放的過程主要是通過一種所謂的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)促進(jìn)核酸釋放入細(xì)胞質(zhì)。PEI的轉(zhuǎn)染效率很大程度依賴于自身的理化特性(如相對分子質(zhì)量、分支程度及陽離子電荷密度)、核酸形成復(fù)合物的特性(如顆粒大小、界面電位)、具體實驗條件(如孵化時間、聚合物濃度)[16]。利用PEI作為載體，負(fù)載DNA和siRNA已經(jīng)成功地在動物模型體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

5 無機(jī)納米載體

隨著生物納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用，無機(jī)納米載體在基因非病毒轉(zhuǎn)運載體的應(yīng)用也逐漸成為一個熱點研究領(lǐng)域。目前常使用的非病毒基因載體主要包括以下幾種：金屬納米顆粒，如納米金、磁性納米顆粒；無機(jī)非金屬納米顆粒，如二氧化硅、磷酸鈣、羥基磷灰石；生物降解性高分子納米顆粒，如聚乳酸微球、納米凝膠及生物顆粒，如蛋白質(zhì)、糖蛋白等。這些納米顆粒載體具有低毒、無免疫原性、易于修飾、單分散粒子尺寸及在體內(nèi)代謝時間長等優(yōu)點[13]。金納米粒具有多種優(yōu)秀的生物學(xué)性質(zhì)，如易于對其進(jìn)行表面功能化，負(fù)載基因能力強(qiáng)，細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)染效率高等。Crew等[17]將antimiR-130b通過硫醇基耦合的金納米粒，制備出antimiR-130b/金納米粒。通過凝膠電泳實驗證實miRNA/金納米粒的表面穩(wěn)定性好，共聚焦顯微鏡顯示Cy5標(biāo)記的miRNA/金納米粒被細(xì)胞內(nèi)吞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。

6 水凝膠載體

水凝膠是由多種天然或人工合成的親水性聚合物交聯(lián)或自組裝所形成，對基因、蛋白、抗腫瘤藥物等均具有一定的緩釋性，包封率高，加載藥物方便，非常適合作為miRNA等核酸的載體及儲藏庫，并可以持續(xù)釋放基因類藥物。Nguyen等[18]將siRNA/miRNA和MSCs包封在聚乙二醇水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)中，觀察siRNA對MSCs分化的影響。siRNA/miRNA在水凝膠中可以持續(xù)釋放3～6 d并可以促進(jìn)被包封的MSCs成骨方向分化。Ma等[19]觀察了以殼聚糖溫敏凝膠作為RNAi載體和儲藏庫對小鼠巨噬細(xì)胞RANK信號的沉默效果。發(fā)現(xiàn)殼聚糖溫敏凝膠可以在體外控釋Cy3標(biāo)記的siRNA。殼聚糖溫敏凝膠負(fù)載RNAi并未顯示出明顯的細(xì)胞毒性，并且對細(xì)胞RANK信號的特異性沉默效果延長到9 d。

綜上所述，尋找和開發(fā)低毒高效的基因轉(zhuǎn)運載體是基因治療應(yīng)用于臨床實踐的前提條件。如何在保持非病毒載體的安全性基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)染效率，是非病毒載體研發(fā)中的熱點與難點。通過改性和修飾非病毒載體的基團(tuán)，優(yōu)化其基因轉(zhuǎn)染能力是今后研究的一個重點方向。

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Viral vectors and non-viral vectors are the two most commonly used gene delivery carriers at present.Although viral vectors，such as adenovirus and lentivirus have higher transfection efficiency，the security problems of cell toxicity and potential mutagenicity and high immunogenicity restrict them from further clinical application.Non-viral vectors，such as natural polysaccharide polymers，cationic polymers，liposomes and inorganic nano-carriers have the advantages of simple structure，controllable preparation process，low immunogenicity and so on.This article reviews the research progress of non-viral gene vectors.

Gene；Vector；Review

2016-09-08)

青島市市南區(qū)公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目(2014-14-047-SW)

1005-619X(2017)02-0134-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.008

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惠光艷