趙 靜，趙金銀，陳志霞，鐘 巍，李龍蕓，劉利成，胡小許，陳唯軍，王孟昭

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 1007302中國科學(xué)院 北京基因組研究所基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

·論 著·

建立實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測非小細(xì)胞肺癌棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變淋巴瘤激酶融合基因

趙 靜1，趙金銀2，陳志霞1，鐘 巍1，李龍蕓1，劉利成2，胡小許2，陳唯軍2，王孟昭1

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 1007302中國科學(xué)院 北京基因組研究所基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

目的 建立一種實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，對非小細(xì)胞肺癌間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因進(jìn)行快速、敏感和特異檢測。方法 首先，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，針對棘皮動物微管相關(guān)蛋白4(EML4)-ALK常見融合變異V1、V2、V3a和V3b設(shè)計(jì)引物和Taqman水解探針。然后，以包含EML4-ALK融合變異V1、V2、V3a和V3b的假病毒顆粒為研究對象，進(jìn)一步分析所建立方法的靈敏度、敏感性和特異性。最后，用所建立的方法檢測50例非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本，其中包含3例ALK-熒光原位雜交(FISH)(+)樣本。結(jié)果 在無背景RNA干擾情況下，建立的實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測靈敏度高達(dá)10拷貝/l。在500 拷貝/l的野生型背景RNA下，其敏感性達(dá)1%，在5000 拷貝/l的野生型背景RNA下，其敏感性達(dá)0.5%。對于檢測特異性，以正常人白細(xì)胞及血漿RNA為研究對象，均未見非特異性擴(kuò)增。對50例非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，47例陰性標(biāo)本檢測均為陰性，3例ALK-FISH(+)標(biāo)本2例檢測陽性，1例未檢出，未檢出原因與標(biāo)本RNA提取失敗有關(guān)。結(jié)論 本研究建立的實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法是一種快速、簡便以及具有高靈敏度和特異性的EML4-ALK融合基因檢測方法，值得在臨床進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣。

非小細(xì)胞肺癌；棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變淋巴瘤激酶融合基因；實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)

ActaAcadMedSin，2016,38(6)：643-649

具有棘皮動物微管相關(guān)蛋白4(echinoderm microtubule associated protein like 4， EML4)-間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase， ALK)融合基因的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)是新近發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特亞型，具有該亞型的NSCLC對ALK抑制劑，如克唑替尼[1- 2]，療效顯著優(yōu)于化療。因此，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，對ALK融合基因進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的檢測顯得尤為重要。目前關(guān)于ALK融合基因的檢測方法很多，它們分別從DNA、RNA以及蛋白水平進(jìn)行檢測，各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中，基于PCR基礎(chǔ)上的方法，靈敏度高、檢測快速、結(jié)果容易判斷、可對石蠟包埋組織進(jìn)行測定、檢測多個已知亞型、還可結(jié)合測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新類型，應(yīng)用前景良好。為此，本研究自主構(gòu)建了實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法(real-time quantitative reverse transcriptase-PCR， qRT-PCR)，用于檢測NSCLC的ALK融合基因。

材料和方法

EML4-ALK融合位點(diǎn)引物及Taqman探針設(shè)計(jì) 在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫下載EML4和ALK全基因序列(僅外顯子)，根據(jù)Sanger網(wǎng)站(http：//cancer.sanger.ac.uk/cosmic)及文獻(xiàn)報(bào)道確定EML4-ALK的15種融合突變，其中最常見的融合突變?yōu)镋ML4-ALK,E13；A20(V1)，E6；A20(V3a/b)和E20；A20(V2)占EML4-ALK融合類型的70%以上[3- 4]。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件對EML4-ALK的15種融合突變分別設(shè)計(jì)引物和探針，并以管家基因β-actin的mRNA作為內(nèi)參。引物長度為22 bp左右，GC含量為40%～60%，Tm值為55～58℃，擴(kuò)增片段大小為80～150 bp，形成盡可能少的引物二聚體，探針長度為26～30 bp，GC含量為40%～60%，Tm值為65～70℃(序列見表1)。因涉及試劑盒商業(yè)開發(fā)，此處未列出全部融合變異的引物和Taqman探針。

EML4-ALK融合基因檢測設(shè)2個反應(yīng)管進(jìn)行，其中V1/V6、V2/COSMIC ID731、V3a/V3b、V4/V7、V4’和V5’設(shè)在一個反應(yīng)管進(jìn)行，V5a/V5b/COSMIC ID733、V8a/V8b及內(nèi)參β-actin設(shè)在另一反應(yīng)管中進(jìn)行。以攜帶EML4-ALK融合變異V1、V2、V3a和V3b的假病毒顆粒標(biāo)準(zhǔn)品(中國科學(xué)院北京基因組研究所贈送)為研究對象，篩選和確立最佳引物和探針。

表 1 檢測EML4-ALK融合基因V1、V2和V3a/b融合位點(diǎn)及內(nèi)參設(shè)計(jì)的引物和Taqman探針序列

EML4-ALK：棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變淋巴瘤激酶

EML4-ALK：echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase

靈敏度實(shí)驗(yàn) 從-80℃冰箱中取出攜帶EML4-ALK V1、V2、V3a和V3b融合位點(diǎn)的假病毒顆粒，提取假病毒RNA，分別進(jìn)行梯度稀釋，選取104、103、102、101、100拷貝/l稀釋梯度，按上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)孔。

敏感性實(shí)驗(yàn) 分別將梯度稀釋的突變體V1假病毒RNA加入到500 拷貝/l和5000拷貝/l的野生型背景RNA中，分別制成依次為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%突變率的樣本，按上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，以確定可檢測的敏感性。V2、V3a/V3b突變體按相同方法建立突變率樣本，按上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，以確定可檢測的敏感性。

特異性實(shí)驗(yàn)及ΔCt臨界值的確定 選取10份正常人血液樣本(來自中國科學(xué)院北京基因組研究所基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工作人員)，提取白細(xì)胞RNA，濃度1～50 ng/l，進(jìn)行6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)每次出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增Ct值及樣本內(nèi)參Ct值，計(jì)算出ΔCt值(ΔCt=Ct非特異-Ct內(nèi)參)。依據(jù)公式ΔCt臨界值=平均ΔCt-3×標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出ΔCt臨界值。收集40份血液樣本(來自北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科血漿標(biāo)本庫)，提取血漿中的RNA，按上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證特異性。

臨床樣本收集 NSCLC標(biāo)本來自2012年1至12月北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科，共50例，其中男性12例、女性38例，均為腺癌樣本，且均采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)方法對EML4-ALK融合基因進(jìn)行檢測。其中ALK-FISH(+)標(biāo)本僅3例，均為女性，腺癌，且不吸煙。

石蠟組織樣本RNA提取 每例標(biāo)本切取5 μm厚石蠟切片5張。采用離心柱法提取石蠟切片中的RNA(使用商品化Tiangen DNA/RNA共提取試劑盒，貨號：DP422)，用紫外分光光度計(jì)測定所得RNA溶液的濃度，最后置于-80℃保存，備用。

實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測臨床樣本 按照建立的qRT-PCR方法對臨床樣本進(jìn)行檢測，并設(shè)1個陰性對照樣本(采用純水代替)和1個陽性對照樣本(攜帶EML4-ALK V1融合位點(diǎn)的假病毒顆粒RNA)。計(jì)算出每個樣本的△Ct(△Ct=Ct檢測反應(yīng)-Ct內(nèi)參)，依據(jù)所確定的△Ct臨界值判斷結(jié)果。若△Ct值小于△Ct臨界值，則為陽性樣本；若△Ct值大于△Ct臨界值，則為陰性樣本或超出檢測范圍。

結(jié) 果

qRT-PCR反應(yīng)體系檢測靈敏度結(jié)果 對EML4-ALK融合變異V1、V2、V3a和V3b分別進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，各種融合變異的濃度梯度依次為104、103、102、101、100拷貝/l，最低檢測限均為101拷貝l。圖1所示為EML4-ALK融合變異V1、V2檢測靈敏度均為101拷貝/l。

A.V1；B.V2

圖 1 EML4-ALK融合突變擴(kuò)增曲線，突變型RNA濃度梯度依次為：104、103、102、101、100拷貝/l

Fig 1 Amplification curves of variants of EML4-ALK fusion gene， and the concentrations of variant was 104， 103， 102， 101， 100copies/l， respectively

△Ct臨界值設(shè)定及特異性驗(yàn)證 以10份白細(xì)胞RNA為對象，濃度1～50 ng/μl，進(jìn)行△Ct臨界值統(tǒng)計(jì)，所有反應(yīng)均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，以Ct值為40計(jì)算，最小ΔCt為7.9，最大ΔCt為19.13，依據(jù)公式：ΔCt 臨界值=平均ΔCt-3×標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算得出△Ct臨界值為10。采用40份正常血漿樣本進(jìn)行特異性驗(yàn)證。從40份血漿中提取RNA，定量后，稀釋至0～15 g/μl，結(jié)果顯示均無非特異擴(kuò)增信號出現(xiàn)。

NSCLC臨床樣本檢測結(jié)果 50例NSCLC臨床標(biāo)本采用qRT-PCR檢測EML4-ALK融合基因。其中47例ALK-FISH(-)標(biāo)本內(nèi)參擴(kuò)增正常，樣本檢測均為陰性，3例ALK-FISH(+)樣本在第1反應(yīng)管中有2例(R2，R3)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，即存在EML4-ALK融合基因，另1例(R1)未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。在第2反應(yīng)管中，標(biāo)本R2和R3仍出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其本質(zhì)為內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增曲線，而R1標(biāo)本內(nèi)參β-actin未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，即R1檢測失敗與RNA提取失敗有關(guān)(圖3)。

討 論

EML4-ALK融合基因是NSCLC一種新的亞型，約占所有NSCLC的5%，在腺癌、年輕患者(<60歲)以及不吸煙人群中發(fā)生率高，不同人種之間發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并均可從ALK抑制劑治療中獲益[1- 2，5- 6]。因此，建立簡單、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的檢測EML4-ALK融合基因方法極為重要。

目前針對ALK融合基因檢測常用的方法主要有3種： FISH、針對融合蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)和逆轉(zhuǎn)錄PCR。這3種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。FISH法雖然是臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)方法，但價(jià)格昂貴，操作規(guī)范要求高，結(jié)果判讀只能由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師完成，ALK-FISH陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)尚存爭議[7]，且只能判斷ALK基因是否發(fā)生斷裂，無法區(qū)分與其發(fā)生融合的基因類型。IHC法簡便易行，費(fèi)用低，但I(xiàn)HC陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)存在一定主觀性。為提高IHC診斷特異性，2013年羅氏/Ventana公司在BenchMark平臺上進(jìn)一步優(yōu)化了ALK-D5F3抗體試劑盒及檢測流程。通過在該試劑盒中引入兩級放大Optiview系統(tǒng)，使得原本表達(dá)非常弱的ALK融合蛋白得以呈現(xiàn)較為明顯的染色效果。多項(xiàng)采用Ventana IHC檢測ALK融合蛋白的研究顯示，與FISH檢測結(jié)果相比，兩者的一致率高達(dá)94%～100%[8- 11]。因此，歐盟、中國以及美國等陸續(xù)批準(zhǔn)Ventana IHC用于檢測ALK融合基因，并可指導(dǎo)ALK抑制劑治療，但該方法需要使用Ventana全自動染色儀，在我國大部分實(shí)驗(yàn)室尚不具備此條件。而逆轉(zhuǎn)錄PCR具有操作簡便、結(jié)果判讀容易、省時等優(yōu)點(diǎn)，而且可以開發(fā)為專用試劑盒，適合于在我國廣大分子病理實(shí)驗(yàn)室開展。

圖 2 不同濃度的EML4-ALK融合突變V1擴(kuò)增曲線[在500 拷貝/l(A)和5000 拷貝/l(B)的野生型RNA背景下]顯示可分別檢出1%和0.5%的突變率

Fig 2 The EML4-ALK V1 amplification curves for different concentrations of mutant pseudovirus [under the background of 500 copies/l(A) and 5000 copies/l(B) wild-type pseudovirus] showed the detection resolution was 1% and 0.5%

圖 3 在第1個(A)和第2個(B)反應(yīng)管中3份非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本(R1、R2、R3)擴(kuò)增曲線

Fig 3 Amplification curves of 3 non-small cell lung cancer samples(R1，R2，R3)in the first (A) and second reaction tubes (B)

本研究建立了實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，從mRNA水平檢測是否存在EML4-ALK融合基因的轉(zhuǎn)錄子，進(jìn)而判斷是否存在ALK融合基因。初步研究結(jié)果顯示，在無背景RNA干擾情況下，該方法的檢測靈敏度高達(dá)10 拷貝/l。在500 拷貝/l的野生型背景RNA下，其敏感性達(dá)1%，在5000 拷貝/l的野生型背景RNA下，其敏感性達(dá)0.5%。而且對正常人白細(xì)胞RNA以及血漿RNA檢測，均未見非特異性擴(kuò)增，顯示該方法具有較高特異性。在對3例FISH陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測時，2例出現(xiàn)陽性，顯示qRT-PCR和FISH檢測結(jié)果具有高度可比性。另1例未檢出，原因與RNA提取失敗有關(guān)。對于石蠟組織標(biāo)本，RNA在標(biāo)本制備和保存過程中降解明顯，因此可能導(dǎo)致RNA提取失敗，無法采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測。因此，與文獻(xiàn)報(bào)道和指南推薦一致[12- 13]，使用qRT-PCR檢測EML4-ALK融合基因時優(yōu)先推薦新鮮標(biāo)本，其次為冰凍標(biāo)本，最后為石蠟組織標(biāo)本。目前，國內(nèi)外報(bào)道的qRT-PCR方法的檢測靈敏度為1～100 拷貝/l[14- 16]，本研究建立的方法亦具有相似甚至更高的檢測靈敏度，達(dá)到10 拷貝/l，并且涵蓋EML4-ALK融合基因的類型高達(dá)15種(V1、V2、V3a、V3b、V4、V4’、V5a、V5b、V5’、V6、V7、V8a、V8b、COSF731、COSF733)，占ALK融合基因70%以上，高于國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的廈門艾德EML4-ALK融合基因試劑盒所覆蓋的類型。與測序法相比，該方法僅能檢測已知融合類型，不能探索和發(fā)現(xiàn)新的融合類型，此為局限。同時在下一步研究中，擬新設(shè)反應(yīng)管，加入KIF5B-ALK[17]、TRK-ALK[18]、KLC1-ALK[19]、PTPN3-ALK[20]以及STRN-ALK[20]融合基因檢測，以涵蓋目前文獻(xiàn)所報(bào)道的全部ALK融合基因類型。另外，本研究臨床樣本檢測少，下一步需要進(jìn)行更大規(guī)模的臨床樣本檢測，并與廈門艾德EML4-ALK試劑盒、ALK-D5F3 Ventana IHC以及雅培FISH法相比較，更加全面系統(tǒng)評價(jià)該方法的優(yōu)劣。

綜上，本研究構(gòu)建的qRT-PCR法是一種高靈敏度和特異性的EML4-ALK融合基因檢測方法，使用方便、價(jià)格低廉，值得在臨床上進(jìn)一步推廣。

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Detection of Echinoderm Microtubule Associated Protein Like 4-Anaplastic Lymphoma Kinase Fusion Genes in Non-small Cell Lung Cancer Clinical Samples by a Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Method

ZHAO Jing1， ZHAO Jin-yin2， CHEN Zhi-xia1， ZHONG Wei1， LI Long-yun1， LIU Li-cheng2， HU Xiao-xu2， CHEN Wei-jun2， WANG Meng-zhao1

1Department of Respiratory Medicine， PUMC Hospital， CAMS and PUMC， Beijing 100730， China2Key Laboratory of Genome Sciences and Information， Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences， Beijing 100029， China

WANG Meng-zhao Tel： 010- 69155039， E-mail： mengzhaowang@sina.com

Objective To establish a real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay (qRT-PCR) for the rapid， sensitive， and specific detection of echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK) fusion genes in non-small cell lung cancer. Methods The specific primers for the four variants of EML4-ALK fusion genes (V1， V2， V3a， and V3b) and Taqman fluorescence probes for the detection of the target sequences were carefully designed by the Primer Premier 5.0 software. Then， using pseudovirus containing EML4-ALK fusion genes variants (V1， V2， V3a， and V3b) as the study objects， we further analyzed the lower limit， sensitivity， and specificity of this method. Finally， 50 clinical samples， including 3 ALK-fluorescence in situ hybridization (FISH) positive specimens， were collected and used to detect EML4-ALK fusion genes using this method. Results The lower limit of this method for the detection of EML4-ALK fusion genes was 10 copies/l if no interference of background RNA existed. Regarding the method’s sensitivity， the detection resolution was as high as 1% and 0.5% in the background of 500 and 5000 copies/l wild-type ALK gene， respectively. Regarding the method’s specificity， no non-specific amplification was found when it was used to detect EML4-ALK fusion genes in leukocyte and plasma RNA samples from healthy volunteers. Among the 50 clinical samples， 47 ALK-FISH negative samples were also negative. Among 3 ALK-FISH positive samples， 2 cases were detected positive using this method， but another was not detected because of the failure of RNA extraction. Conclusion The proposed qRT-PCR assay for the detection of EML4-ALK fusion genes is rapid， simple， sensitive， and specific， which is deserved to be validated and widely used in clinical settings.

non-small cell lung cancer； echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase fusion gene； real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

王孟昭 電話：010- 69155039，電子郵件：mengzhaowang@sina.com

R734.2

A

1000- 503X(2016)06- 0643- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.06.004

2015- 10- 10)