張淑華，李云鳳，趙寶鶴，張吉奎，楊亞軒，高文育，徐福海，鄭福和，于水江，王華新

（1.黃驊開發(fā)區(qū)博愛醫(yī)院，河北 黃驊 061100；2.唐山市豐潤區(qū)疾控中心，河北 唐山 063000）

評價膽紅素對肌氨酸氧化酶法測定肌酐的干擾

張淑華1，李云鳳1，趙寶鶴2，張吉奎1，楊亞軒1，高文育1，徐福海1，鄭福和1，于水江1，王華新1

（1.黃驊開發(fā)區(qū)博愛醫(yī)院，河北 黃驊 061100；2.唐山市豐潤區(qū)疾控中心，河北 唐山 063000）

目的評價膽紅素對肌氨酸氧化酶法測定肌酐（Cr）的干擾。方法隨機選擇國內(nèi)威高、長征、九強、生之源、基蛋、利德曼6種肌氨酸氧化酶法Cr試劑盒，按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會EP 7-A2文件中“配對差異”和“劑量效應(yīng)”方案，在正常和高值 Cr血清中添加不同濃度結(jié)合膽紅素（CBIL）和游離膽紅素（FBIL）干擾物，進行干擾評價試驗。結(jié)果CBIL和FBIL對肌氨酸氧化酶法測定Cr存在不同程度的干擾。Cr正常水平，CBIL和FBIL≥120μmol／L時對威高、基蛋Cr試劑產(chǎn)生明顯干擾，CBIL≥621μmol／L或 FBIL≥481μmol／L時對九強、生之源、長征 Cr試劑產(chǎn)生干擾；Cr高值水平，CBIL或FBIL≥120μmol／L時對威高 Cr試劑產(chǎn)生干擾，CBIL≥962μmol／L或 FBIL≥1083μmol／L時對長征 Cr試劑產(chǎn)生干擾。干擾所產(chǎn)生的相對偏倚差異顯著，CBIL較比FBIL干擾作用更加明顯。“劑量效應(yīng)”結(jié)果顯示，膽紅素對 Cr測定產(chǎn)生負干擾并呈線性關(guān)系。結(jié)論國內(nèi)肌氨酸氧化酶法測定 Cr試劑抗膽紅素干擾能力不同，膽紅素對 Cr測定產(chǎn)生負干擾并呈線性關(guān)系。臨床實驗室在應(yīng)用肌氨酸氧化酶法測定 Cr時應(yīng)進行膽紅素干擾試驗驗證。

肌氨酸氧化酶法； 肌酐； 膽紅素干擾； 干擾試驗

肌酐（creatinine，Cr）是人體肌肉組織中肌酸及磷酸肌酸代謝終產(chǎn)物，血液中 Cr水平受飲食中攝取的外源性 Cr及人體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性 Cr的影響，正常成人Cr生成速率基本穩(wěn)定，血 Cr及尿 Cr測定廣泛應(yīng)用于評估腎小球濾過功能。國內(nèi)大多實驗室已將 Cr的Jaff堿性苦味酸法改進為酶法，在 3種酶法中應(yīng)用較多的是肌酐酸偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法（簡稱酶法）。該法以Tinder為反應(yīng)指示，該反應(yīng)體系中易受膽紅素、維生素 C等還原性物質(zhì)干擾［1］，膽紅素的干擾可用亞鐵氰化鉀或膽紅素氧化酶等清除。為評估國內(nèi)肌酐酸偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法測定Cr抗膽紅素干擾能力，隨機選擇國內(nèi)6家不同 Cr試劑，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）EP 7-A2文件進行“配對差異”和“劑量效應(yīng)”試驗。

材料和方法

1 研究樣本

選取門（急）診、住院患者血清標本中，外觀無溶血、黃疸、乳糜的正常和高值 Cr混合新鮮血清各20mL分為2管，1管用于批內(nèi)精密度試驗，1管用于“配對差異”試驗。

2 試劑和儀器

隨機選擇6種國內(nèi) Cr試劑及配套校準品：山東威高批號20151201A、上海長征批號D1511083、武漢生之源批號 16030727-A2、北京九強批號15-1029、吉林 基 蛋 批號 S20151116、北 京利 德 曼 批 號5111911。質(zhì)控品購 自伯樂 （BIO-RAD）批號 為lot14491、lot14492；干擾試劑盒為 Sysmex公司 APlus試劑盒，批號 ZS4003。檢測 儀器 為Beckman5811全自動生化分析儀。

3 方法

3.1 Beckman5811全自動生化分析儀校準和質(zhì)控

測試參數(shù)、儀器校準按照試劑說明書和儀器說明書設(shè)置、校準。在進行樣本測定前按照質(zhì)控 SOP文件進行室內(nèi)質(zhì)控，在控時進行樣本檢測。

3.2 批內(nèi)精密度

按照 CLSI EP5-A2實驗方案和要求進行精密度評價。Cr正常和高值 2種水平混合新鮮血清，用6種試劑在1天內(nèi)每批間隔重復(fù)測試10次，按照 EP5-A2方案剔除離群值，計算均值（x）、標準差（s）、CV%值。根據(jù)我國WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量目標》規(guī)定，Cr最大允許CV%為4.0%［1］，本研究規(guī)定≤4.0%為批內(nèi)精密度要求。

3.3 配對差異實驗

3.3.1 樣本準備

（1）參考 EP 7-A2文件，選擇 Cr正常值和高值血清作為基礎(chǔ)樣本。

（2）按照 A-Plus試劑盒要求復(fù)溶結(jié)合膽紅素（CBIl）、游離膽紅素（FBIl）干擾試劑和空白液，復(fù)溶后干擾物FBIl和 CBIl濃度為3610μmol／L。

（3）分別用基礎(chǔ)樣本稀釋復(fù)溶后的膽紅素干擾試劑和 空 白 液，稀釋 后 FBIl和 CBIl濃度 為1203μmol／L。將Cr正常值含 CBIl干擾試劑記作A1，Cr正常值含 CBIl空白液記作 B1，Cr正常值含F(xiàn)BIl干擾試劑記作C1，Cr正常值含F(xiàn)BIl空白液記作D1；Cr高值含CBIl干擾試劑記作A2，Cr高值含CBIl空白液記作B2，Cr高值含F(xiàn)BIl干擾試劑記作C2，Cr高值含 FBIl空白液記作 D2。

（4）按照 B1-A1、D1-C1、B2-A2、D2-C2配對稀釋，稀釋后 CBIl、FBIl系列濃度為1203、1083、962、842、722、602、481、361、241、120、0μmol／L共 22個樣品。

3.3.2 確定重復(fù)測定次數(shù)

計算某濃度水平可接受的最大允許干擾值（dmax）與批內(nèi)標準差（s）比值，查 dmax／s重測對應(yīng)表［2］，根據(jù)我國WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量目標》規(guī)定，Cr允許最大bias為5.5%。

3.3.3 干擾效應(yīng)

按照交互順序檢測 22個樣品。正常及高值 Cr檢測結(jié)果偏倚超過 dmax時為產(chǎn)生干擾效應(yīng)。若存在干擾效應(yīng)則進行干擾計量效應(yīng)分析。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果通過分析軟件SPSS 22分析，計算x、s、CV，用最小二乘法進行回歸分析，確定斜率、截距。

結(jié) 果

1 精密度

6種Cr試劑盒批內(nèi) CV均符合 WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量目標》規(guī)定Cr最大允許 CV%為4.0%的要求，可以進行干擾試 驗研究。具體數(shù)據(jù)見表1。

表 16種國內(nèi) Cr試劑日內(nèi)精密度及 dmax／s（n＝10）

2 配對差異試驗

2.1 重復(fù)測定次數(shù)的確定

從表1可見，6種試劑檢測 Cr正常值 dmax／s接近 2.5，經(jīng)查表［2］，樣本重復(fù)次數(shù)為 5次；Cr高值dmax／s最小值為 3.25＞3，查表確定重復(fù)測定次數(shù)為3次。

2.2 干擾效應(yīng)

干擾效應(yīng)判斷標準：基礎(chǔ)Cr濃度 ×（1-5.5%）為 cut-off值，當(dāng)檢測值＜cut-off值時可判斷為產(chǎn)生干擾。6種試劑測定正常和高值Cr的 cut-off值見表2。

根據(jù)表2中 cut-off值，分析表3、表4數(shù)據(jù)表明，膽紅素對6種試劑檢測 Cr均存在干擾，但產(chǎn)生干擾時膽紅素濃度差異較大。Cr正常水平，CBIL和FBIL≥120μmol／L時對威高、基蛋試劑產(chǎn)生明顯干擾，CBIL≥621μmol／L或 FBIL≥481μmol／L時對九強、生之源、長征試劑產(chǎn)生干擾；Cr高值水平，CBIL或FBIL≥120μmol／L時對威高試劑產(chǎn)生干擾，CBIL≥962μmol／L或FBIL≥1083μmol／L時對長征試劑產(chǎn)生干擾。361μmol／L CBIL、FBIL干擾產(chǎn)生的相對偏倚見表5。從表3和表4結(jié)果計算可知，相同濃度干擾物對不同廠家的試劑所產(chǎn)生干擾的相對偏倚差異顯著，以上數(shù)據(jù)也顯示，相同濃度下CBIL對測定Cr干擾強于 FBIL，威高和基蛋試劑表現(xiàn)更加明顯（P＜0.05）。

表2 6種試劑測定Cr干擾效應(yīng) cut-off值（μmol／L）

表3 CBIL和 FBIL干擾正常 Cr水平檢測結(jié)果（x，μmol／L）

表4 CBIL和 FBIL干擾高值 Cr水平檢測結(jié)果（x，μmol／L）

表5 361μmol／L CBIL、FBIL濃度產(chǎn)生的相對偏倚（%）

根據(jù)表2、表3和表4比較 CBIL和 FBIL產(chǎn)生干擾效應(yīng)濃度，見圖1、圖2。

圖 1和圖 2顯示，威高和基蛋試劑抗膽紅素干擾能力較弱，九強和長征抗膽紅素干擾能力較強。

2.3 劑量效應(yīng)

除長征和九強在膽紅素極高濃度下產(chǎn)生干擾且產(chǎn)生較小偏倚外，其他4種試劑測定正常和高值Cr膽紅素均產(chǎn)生了明顯干擾效應(yīng)，膽紅素對測定產(chǎn)生負干擾，4種試劑劑量效應(yīng)分析結(jié)果見表6。

表6 CBIL和 FBIL劑量效應(yīng)分析

討 論

膽紅素（bilirubin）是由體內(nèi)鐵卟啉化合物代謝產(chǎn)生的具有抗氧化性的混合物，主要有兩種存在形式，一類與白蛋白結(jié)合的稱為結(jié)合膽紅素（CBIL），另一類未與白蛋白結(jié)合的稱為游離膽紅素（FBIl）。膽紅素不僅因顏色特性對比色檢測方法有干擾，而且因其具有抗氧化性對 Tinder反應(yīng)指示的反應(yīng)體系也有干擾。膽紅素對酶法測定肌酐產(chǎn)生負干擾，這是因為膽紅素作為還原劑與 Tinder反應(yīng)體系中氧化劑 H2O2發(fā)生反應(yīng)，使得終產(chǎn)物減少，如在R1試劑中加入亞鐵氰化鉀、抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等可消除膽紅素的干擾［3］。

Nah［4］調(diào)查了4種酶法和2種 Jaffe法測定 Cr試劑，調(diào)查結(jié)果顯示，4種酶法試劑不受總膽紅素（中位數(shù)165.1μmol／L，范圍75.58～330.17μmol／L）干擾；國秀芝［5］調(diào)查比較了 4種國產(chǎn)和 2種進口酶法Cr試劑抗膽紅素干擾能力，當(dāng) CBIL≤332μmol／L、FBIL≤327μmol／L時對6種Cr試劑無干擾。本次研究隨機選擇的國內(nèi)6種酶法試劑，結(jié)果顯示，除了長征和九強試劑外，威高、基蛋、利德曼、生之源4種試劑受 CBIL、FBIL干擾明顯，CBIL比FBIL干擾相對較強。當(dāng)CBIL濃 度 接 近 國 秀 芝［5］試驗濃度（332μmol／L）時，正常 Cr水平，威高、基蛋、利德曼、生之源試劑相對偏倚分別為 47.10%、24.65%、9.33%、9.25%；高值 Cr水平，威高、基蛋、利德曼、生之源試劑相對偏倚分別為 30.55%、13.72%、5.96%、5.60%。相對偏倚均超過我國 WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量目標》中規(guī)定的Cr允許最大 bias為 5.5%的標準［1］。6種酶法 Cr試劑盒抗膽紅素干擾能力差異明顯，推測可能是試劑中添加破壞膽紅素干擾物質(zhì)的量不同。

Cr是臨床最常用的腎功能指標，是評估腎小球濾過率（GFR）的重要參數(shù)，檢測結(jié)果的準確性直接影響腎病分期、評估預(yù)后［6］。對急性或慢性腎病合并黃疸時或黃疸合并腎病患者，能避免膽紅素干擾而準確檢測 Cr，正確評估 GFR顯得尤為重要。應(yīng)用酶法檢測 Cr時進行抗干擾能力性能驗證，若存在明顯干擾時可經(jīng)劑量效應(yīng)試驗建立回歸方程，對測定結(jié)果進行回歸分析可得出較為準確的結(jié)果。

CBIL和 FBIL都均有抗氧化劑作用，對測定Cr都具有干擾作用，但干擾效應(yīng)不同，其產(chǎn)生機制尚待進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)酶法 Cr試劑抗膽紅素能力存在顯著差異，膽紅素對Cr測定存在負干擾并呈線性關(guān)系。試劑廠家應(yīng)在說明書中明確其抗干擾能力，臨床實驗室在應(yīng)用時應(yīng)進行干擾試驗驗證。

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（李 雁 張增武編輯）

Evaluation of Biliruin Interference of Creatinine by Sarcosine Oxidase Method

ZHANG Shu-hua，LI Yun-feng，ZHAO Bao-he，ZHANG Ji-kui，YANG Ya-xuan，GAO Wen-yu，XU Fu-hai，ZHENG Fu-he，YU Shui-jiang，WANG Hua-xin
（Boai Hospital of Huanghua City，Huanghua 061100，China）

ObjectiveTo investigate the interference and result bias of bilirubin by Sarcosine oxidase method in determination of creatinine.MethodsTo evaluate the anti-interference ability，we randomly selected 6 kinds ofSarcosine oxidase method forthe determination ofcreatinine（WEIGAO，CHANGZHENG，SHENGZHIYUAN，JIUQIANG，JIDAN，LIDEMAN）.According to the“paired difference”and“doseresponse”documents from Clinical and Laboratory Standards Institute NCCLS EP7-A2， the interference tests were conducted by adding different concentrations of conjugated bilirubin（CBIL）and freed bilirubin（FBIL）to normal and high levels creatinine in serum.ResultsThe CBIL and FBIL had different degrees of interference to the determination of creatinine，but the anti-interference ability of the reagents was different.At normal creatinine level，WEIGAO or JIDAN revealed interference when CBIL and FBIL≥120μmol／L.When CBIL≥621 μmol／L or FBIL≥481 μmol／L，JIUQIANG，SHENGZHIYUAN and CHANGZHENG revealed interference.At high creatinine levels，WEIGAO also demonstrated interference with CBIL or FBIL≥120μmol／L，CHANGZHENG with≥962 μmol／L CBIL and CHANGZHENG with≥1083 μmol／L FBIL respectively.The relative bias caused by interference was significantly different.The CBIL interference effect was more obvious than the FBIL.The results of“dose-response”showed that there was a negative interference in the determination of serum creatinine with bilirubin，and there was a linear function relationship.ConclusionThe interference ability of anti bilirubin interference in the determination of creatinine reagent was different，and there was a negative interference in the determination of serum creatinine withbilirubin and there was a linear function with them.Clinical laboratories should always conduct validation of bilirubin interference for the determination of creatinine by sarcosine oxidase method.

Sarcosine oxidase method； Creatinine； Bilirubin interference； Interference testing

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.032

2016-07-01；

2016-09-27

河北省衛(wèi)計委指令性課題（1120140226）

李云鳳。E-mail：wanghuaxin004＠163.com