左江華，韓光躍，李書君，田連芳，任宏濤，鄭 煒

（1.河北邢臺市人民醫(yī)院檢驗二科，河北 邢臺 054031；2.河北省疾病預防控制中心病毒所，河北 石家莊 050021；3.河北邢臺市人民醫(yī)院燒傷科，河北 邢臺 054031）

產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥基因分析

左江華1，韓光躍2，李書君1，田連芳1，任宏濤1，鄭 煒3

（1.河北邢臺市人民醫(yī)院檢驗二科，河北 邢臺 054031；2.河北省疾病預防控制中心病毒所，河北 石家莊 050021；3.河北邢臺市人民醫(yī)院燒傷科，河北 邢臺 054031）

目的了解邢臺地區(qū)產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌的分子流行病學特點，為臨床感染預防和治療提供依據(jù)。方法采用最小抑菌濃度（MIC）法檢測產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性，選取 13種特異性引物采用聚合酶鏈反應（PCR）的方法檢測產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌的基因類型。結果2013年1月至2014年3月從邢臺人民醫(yī)院分離出的125株非重復的產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌菌株，耐藥基因以 blaCTX-M的陽性率最高，為92.0%，blaSHV和 blaTEM次之，為82.9%和73.2%。所有菌株均攜帶1種或1種以上的耐藥基因。結論產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐藥現(xiàn)象嚴重，耐藥基因以blaCTX-M、blaSHV和 blaTEM為主。醫(yī)院應加強對ESBLs的監(jiān)測，降低 ESBLs的感染率以及耐藥基因的突變，提高治療感染的效率，防止醫(yī)院感染的發(fā)生。

肺炎克雷伯菌； ESBLs； 多重耐藥； 耐藥基因

肺炎克雷伯菌是一種條件致病菌，也是導致醫(yī)院感染的重要的病原微生物。它可以引起各種感染，包括肺炎、敗血癥、菌血癥、腦膜炎、傷口感染、尿路感染和兒童胃腸炎等［1］。近年來肺炎克雷伯菌耐藥性日趨嚴重，尤其是產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌，給臨床感染治療帶來極大的困難。本研究選取了從2013年1月至 2014年 3月，邢臺市人民醫(yī)院分離出的125株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌作為研究對象，用PCR技術對產(chǎn) ESBLs的肺炎克雷伯菌菌株進行基因擴增確定其基因型，掌握邢臺地區(qū)產(chǎn) ESBLs的肺炎克雷伯菌基因型特點，以便指導臨床合理用藥，防止醫(yī)院感染。

材料與方法

1 菌株來源

2013年1月至2014年3月，選取從邢臺市人民醫(yī)院門診及住院患者中分離出的125株非重復的產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。

2 儀器和試劑

Phoenix 100微生物鑒定／藥敏分析儀為美國 BD公司產(chǎn)品，Maxwell 16核酸提取儀及試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品，9700 PCR擴增儀為美國 ABI公司產(chǎn)品，瓊脂糖為香港基因公司產(chǎn)品，DYY-12電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品，紫外凝膠成像儀為法國VIBER LOURMAT公司產(chǎn)品，DNA染色劑為北京賽百盛公司產(chǎn)品，DNA Ladder Marker為大連 TaKaRa公司產(chǎn)品。引物由上海生工公司合成。

3 菌株鑒定

菌株鑒定及藥敏試驗由Phoenix 100微生物鑒定／藥敏分析儀來完成，按照 CLSI 2015文件標準判定藥敏結果。采用 CLSI 2015推薦的 ESBLs的表型確證試驗，用肉湯微量稀釋法。確證試驗需要同時使用頭孢他啶（0.25～128μg／mL）、頭孢他啶／克拉維酸（0.25／4～128／4μg／mL）和頭孢噻肟（0.25～64μg／mL）、頭孢噻肟／克拉維酸（0.25／4～64／4 μg／mL），遵照標準的肉湯稀釋法，35±2℃，空氣環(huán)境，孵育16～20h，與克拉維酸聯(lián)合的藥物MIC相對單獨的藥物 MIC減低≥3個倍比稀釋度，即可判定該菌株產(chǎn)ESBLs。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌 ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922。

4 耐藥基因的檢測

ESBLs是由質(zhì)粒介導的能賦予細菌對多種 β-內(nèi)酰胺酶類和單酰環(huán)類抗菌藥物耐藥的一類酶，屬于Ambler A類，位于 Bush功能分類的 2be群［2］，本研究選擇了13種與 ESBLs相關的耐藥基因［3-5］（耐藥基因的引物序列見表1），采用PCR方法，配制25μL的反應體系（2×Mix 12.5μL，引物F、R各1μL，DNA模板4μL和 ddH2O 6.5μL）進行擴增，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，最后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相，出現(xiàn)與目的基因分子大小相當?shù)臈l帶即可判定為陽性。

表1 耐藥基因引物序列

結 果

1 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥性分析

125株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對青霉素類、頭孢類和氨曲南等抗菌藥物呈現(xiàn)出高度耐藥，對頭孢唑林和頭孢噻肟耐藥率為100%，對頭孢他啶的耐藥率最低（74.3%）。在非 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中，對阿米卡星的耐藥率最低為 11.8%；對亞胺培南和美羅培南的耐藥率也分別達到了 10.8%和 7.2%。見表2。

表2 125株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥情況

2 耐藥基因檢測結果

在選取的125株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中，115株（92.0%）檢出 blaCTX-M耐藥基因，其中74株攜帶blaCTX-M-9型耐藥 基 因，64株 攜 帶 blaCTX-M-1型 耐 藥 基因，有 2株攜帶 blaCTX-M-25型耐藥基因，有1株攜帶blaCTX-M-2型耐藥基因；102株（82.9%）攜帶blaSHV耐藥基因；90株（73.2%）攜帶 blaTEM耐藥基因；17株（13.8%）攜帶blaOXA-1耐藥基因；blaOXA-10檢出 2株，blaCTX-M-2和 blaPER各檢出 1 株；blaOXA-2，blaVEB和blaCTX-M-8沒 有 檢出 。

125株產(chǎn) ESBLs的肺炎克雷伯菌株均攜帶 1種或1種以上的耐藥基因。其中9株攜帶1種耐藥基因，38株攜帶2種耐藥基因，70株攜帶 3種耐藥基因，8株攜帶4種耐藥基因。見表3。

表3 125株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因檢出情況

討 論

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科，是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，并以多重耐藥株感染為顯著特點［6］。

產(chǎn) ESBLs是肺炎克雷伯菌耐藥的重要機制之一。該酶能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán) β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。藥敏結果顯示，這125株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物呈現(xiàn)出高度耐藥，對頭孢他啶的耐藥率最低（74.3%）；非 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中，對阿米卡星的耐藥率最低為11.8%。碳青霉烯類抗菌藥物是治療產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌感染最有效的藥物，但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物的使用，對該類抗菌藥物耐藥的菌株也被篩選出來，給臨床抗感染的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，所以應當引起關注和進一步的研究，加強標本的送檢和細菌耐藥監(jiān)測，指導臨床合理用藥，預防和降低感染的發(fā)生。

肺炎克雷伯菌是臨床上分離出的產(chǎn)生 ESBLs的常見細菌之一。根據(jù)分子結構的差異以及水解底物的不 同，ESBLs主 要 分 為 blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaOXA、blaPER、blaVEB、blaGES和 其 他 類 型 的 ESBLs［7］。其 中blaTEM和 blaSHV型 通常 由 位 于質(zhì) 粒 上 編碼blaTEM-1、blaTEM-2和 blaSHV-1結構基因突變，使酶 活性 中心一個或數(shù)個氨基酸發(fā)生取代而引起；blaCTX-M型與blaTEM或 blaSHV僅 有 25% ～38%氨 基 酸 同 源性。ESBLs酶活性能被 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制［8］。

由于世界不同國家和地區(qū)在抗菌藥物的管理和在抗感染治療用藥上的差異，導致產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌在不同地區(qū)流行的耐藥基因類型也存在差別。在美國，以 blaTEM和 blaSHV為主，blaCTX-M也有 增多的趨勢［9］；在歐洲，近年來是以blaTEM和 blaCTX-M為主 要類 型［10］；在 南 美 和 北非 以 blaCTX-M為 主［11-12］；在亞洲，blaCTX-M型 的 傳播 和變 異 的 速 度 也 是 驚 人的［13］。根據(jù)卓超［14］報道，我國臨床分離的肺炎克雷伯菌 產(chǎn) 生 的 ESBLs主 要 為blaCTX-M-14和 blaCTX-M-3型。本研究結果顯示，邢臺地區(qū)分離出的產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌 blaCTX-M型耐藥基因陽性率最高，blaTEM和blaSHV次之。所有菌株均攜帶 1種或 1種以上的耐藥基因，存在攜帶多種耐藥基因的現(xiàn)象。其中頭孢他啶的耐藥率比頭孢噻肟低 25.7%，這與產(chǎn)blaCTX-M型ESBLs能水解頭孢噻肟，但水解頭孢他啶的能力差相符合。有2株只檢出blaSHV型耐藥基因，這 2株是否是ESBLs，有待通過基因測序進一步驗證。

ESBLs耐藥基因由質(zhì)粒介導，可在不同菌株、不同科室、不同地區(qū)間傳播，具有廣泛傳播和暴發(fā)流行的趨勢，應當加強醫(yī)院感染的防控措施，防止其傳播。ESBLs能被 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，所以產(chǎn)酶菌株對含酶抑制劑復方制劑的耐藥率除氨芐西林／舒巴坦外均低于青霉素和頭孢菌素類抗菌藥物，這提示含酶抑制劑復方制劑仍然可以作為治療產(chǎn)ESBLs菌株的經(jīng)驗用藥選擇之一。

綜上所述，我們應當加強對這些產(chǎn) ESBLs菌的監(jiān)測，對重點科室進行流行病學調(diào)查，查明感染源和傳播途徑，并采取有效的感染控制措施，防止多重耐藥菌在醫(yī)院的流行或引起大范圍的傳播。

［1］Ndiba P M.Phenotypic detection and susceptibility pattern for the detection of extended spectrum β-Lactamase-producing Klebsiella pneumonia isolates in Nairobi，Kenya.OJMM，2013，3（2）：91-94.

［2］毛雪瑩，多麗波.RT-PCR技術在肺炎克雷伯菌耐藥性方面的研究進展.標記免疫分析與臨床，2015，22（11）：1169-1172，1175.

［3］Woodford N，F(xiàn)agan E J，Ellington M J.Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extend spectrum β-lactamases.J Antimicrob Chemother，2006，57（1）：154-155.

［4］Lee S，Park Y J，Kim M，et al.Prevalence of ambler class A and D β-lactamases among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Korea.J Antimicrob Chemother，2005，56（1）：122-127.

［5］胡錫浩，許小敏，馮偉云，等.燒傷科銅綠假單胞菌20種β-內(nèi)酰胺酶基因與膜孔蛋白 OprD2基因研究.中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21（21）：4419-4422.

［6］卓超，蘇丹虹，倪語星，等.2010年CHINET肺炎克雷伯菌屬細菌耐藥性監(jiān)測.中國感染與化療雜志，2012，12（3）：174-179.

［7］Paterson D L，Bonomo R A.Extended-spectrum β-lactamases：a clinical update.Clin Microbiol Rev，2005，18（4）：657-686.

［8］孫長貴，陳漢美.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進展.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2000，21（3）：111-115.

［9］BushK.Extended-spectrum β-lactamases in North America，1987-2006.Clin Microbiol Infect，2008，14（Suppl 1）：134-143.

［10］Coque T M，Baquero F，Canton R.Increasing prevalence of ESBLs-producing Entero-bacteriaceae in Europe.Euro Surveill，2008，13（47）：pii：19044.

［11］Turner P J，Greenhalgh J M，Edwards J R，et al.The MYSTIC（meropenem yearly susceptibility testinformation collection）programme.Int J Antimicrob Agents，1999，13（2）：117-125.

［12］Khalaf N G，Eletreby M M，Hanson N D.Characterization of CTXM ESBLs in Enterobacter cloacae，Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae clinical isolates from Cairo，Egypt.BMC Infect Dis，2009，9：84.

［13］Hawkey P M.Prevalence and clonality of extended-spectrum βlactamases in Asia.Clin Microbiol Infect，2008，14（Suppl 1）：159-165.

［14］卓超，蘇丹虹，李紅玉，等.廣州地區(qū)產(chǎn) CTX-M型超廣譜 β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究.中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32（10）：1114-1119.

［15］胡付品，朱德妹，汪復，等.2014年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測.中國感染與化療雜志，2015，15（5）：401-410.

（張增武編輯）

Drug-resistant Genes of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae Strains

ZUO Jiang-hua，HAN Guang-yue，LI Shu-jun，TIAN Lian-fang，REN Hong-tao，ZHENG Wei
（Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital，Xingtai 054031，China）

ObjectiveTo analyze the molecular epidemiological characteristics of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae in Xingtai district and to provide the basis for clinical infection prevention and treatment.MethodsSusceptibility tests of Klebsiella pneumoniae were detected by MIC method.All 13 related genes of ESBLs′resistant were detected by PCR technique.ResultsA total of 125 strains of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae were isolated from Xingtai People′s Hospital from January 2013 to March 2014.The results showed that blaCTX-Mhad the highest positive rate was 92.0%，blaSHVand blaTEMwere 82.9%and 73.2%.All strains carried 1 and more kinds of resistant genes.ConclusionThe ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae existed serious multiple drug resistance phenomenon.blaCTX-M，blaSHVand blaTEMwere the main resistant genotypes.The hospital should strengthen monitoring for the ESBLs strains，reduce ESBLs′infection rates and the resistance gene mutation and improve the efficiency of the treatment and prevent hospital-aquired infection.

Klebsiella pneumoniae；ESBLs； Multi-drug resistance； Resistant gene

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.029

2016-06-14；

2016-06-30

左江華（1982—），男，碩士，主管檢驗師，從事醫(yī)學檢驗工作