馬 延，郭金耀，劉 雷，范 春

（河北省任丘市華北石油管理總醫(yī)院，河北 任丘 062552）

GM1體外誘導人臍帶血間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞研究

馬 延，郭金耀，劉 雷，范 春

（河北省任丘市華北石油管理總醫(yī)院，河北 任丘 062552）

目的研究單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂通過體外誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞并探索其最佳誘導濃度。方法取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，剔除臍動脈和臍靜脈，用酶消化法獲得 MSCs，貼壁培養(yǎng)，采用流式細胞技術(shù)行細胞表型檢測。擴增后，取第4代細胞，分為 A、B、C、D、E 5組，前4組為實驗組，E組為對照組，實驗組各組 GM1濃度分別為：A組50μg／mL、B組100μg／mL、C組150μg／mL、D組200μg／mL，誘導液用L-DMEM培養(yǎng)基配制，對照組僅使用L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導人臍帶血間質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化的作用，每 60min觀察細胞誘導前后的形態(tài)，在第360min時采用免疫細胞染色法檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)絲蛋白（neurofilaments protein H，NF-H）以及神經(jīng)元特異性標記物微管結(jié)合蛋白-2（microtubule associated protein 2，MAP-2）的表達情況，并計算陽性細胞率。結(jié)果①大部分原代細胞在接種9h后貼壁，呈多邊形、菱形，之后變?yōu)殚L梭形，細胞開始以漩渦、放射狀生長。②P3、P5和 P10代細胞表面的分子標記經(jīng)流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，均表達 CD105、CD90和 CD73，卻不表達HLA-DR、CD19、CD11b、CD45以及 CD34。③誘導至第360分鐘后，實驗組各組細胞均有神經(jīng)樣細胞出現(xiàn)，表現(xiàn)為細胞胞體收縮成橢圓形，伸出較長突起，以雙極細胞居多。免疫細胞化學檢測顯示實驗組各組NF-H、MAP-2表達陽性，膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達為陰性，C組（150μg／mL）細胞 NF-H、MAP-2陽性表達率最高。對照組細胞誘導前后變化不明顯。結(jié)論GM1可以誘人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化，150μg／mL為最合適誘導劑量。

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂； 人臍帶間充質(zhì)干細胞； 誘導分化； 神經(jīng)樣細胞

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種可以自我復(fù)制通過具有多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞。Baksh等［1］目前已經(jīng)從臍帶靜脈中分離出間充質(zhì)干細胞，同時發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）具有很好的增殖及分化能力，其取材過程不具有侵襲性以及倫理學限制，因此被認為科研以及臨床研究中的間充質(zhì)干細胞來源。神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside，GS）是一類含唾液酸的糖鞘脂，廣泛存在于脊椎動物各組織細胞膜上，以大腦灰質(zhì)中含量最高，其與神經(jīng)細胞的分化、神經(jīng)樹突的伸長、突觸的形成有重要關(guān)系［2］。較早的研究就已發(fā)現(xiàn)外源性施加神經(jīng)節(jié)苷脂可以促進神經(jīng)系統(tǒng)的再生和突觸的形成。本實驗進行了GM1體外誘導 HUMSCs向神經(jīng)樣細胞分化的研究，并對 HUMSCs的神經(jīng)分化機制進行了探討。

材料和方法

1 臍帶來源

取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康的新生兒臍帶，華北石油管理總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

2 主要試劑

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液，低糖及高糖DMEM／F-12培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，青、鏈霉素霉素溶液（上海拜力生物），DMSO（美國賽默飛世爾科技公司），Triton-X 100（上海索萊寶生物科技有限公司），多聚甲醛（天津市化學制劑研究所），表皮生長因子，F(xiàn)ITC-CD19抗體，F(xiàn)ITC-CD34抗體，PE-CD11b抗體，PE-CD73抗體，PE-CD45抗體，PECD105抗體，PE-CD90抗體，GFAP抗體（BD公司），NF-H抗體（Cell Signaling Technology公司），MAP-2抗體（Millipore公司），PS免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）。

3 HUMSCs的體外分離與擴增

收集足月健康胎兒的臍帶，用磷酸緩沖鹽溶液進行沖洗，去除臍靜脈以及動脈，然后把切割余下臍帶間質(zhì)組織成1mm3小塊，膠原酶Ⅱ（0.2%）進行消化，最后放于DMEM／F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)（2ng／mL表皮細胞生長因子、20%胎牛血清、25mM左旋谷氨酰胺、100μg／mL鏈霉素以及100U／mL青霉素）。待細胞至90%以上融合后棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽洗滌，加胰酶EDTA消化液2mL，37℃消化3min，吹打細胞到完全脫落，離心上清后用培養(yǎng)液重懸細胞，吹打均勻，按照1∶2的比例傳代。在5%CO2、37℃培養(yǎng)，24h后換液，將未貼壁細胞除去，以后每48～72h換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀況。

4 HUMSCs的細胞表型分析

用一對成長期的人臍帶間充質(zhì)干細胞，采用0.25%胰蛋白酶以及0.2g／L的EDTA混合液進行消化，接下來采用PBS沖洗懸浮成單細胞懸液后用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，分別裝于10只1.5mL的EP管中，每管大于106個細胞，之后分別加5μL的鼠抗人單克隆抗體CD45-PE、CD11-PE、CD90-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD19-FITC、CD34-FITC以及 HLADR-PE，剩余兩個 EP管分別加入7μL抗鼠 IgG1-FITC以及 IgG1-PE為對照組，4℃避光孵育 30s；加入少量 PBS沖洗、離心、去上清，重懸細胞后，采用BD公司 LSRFortessa型號流式細胞儀進行檢測。

5 GM1誘導HUMSCs向神經(jīng)樣細胞分化

按照隨機數(shù)表法將細胞分為對照組和觀察組。取生長狀態(tài)良好且處于 對數(shù)生 長期的 P3代HUMSCs，PBS清洗2次后消化，采用 FBS終止消化離心，最后加 1mL培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞按 1× 105／mL濃度分別加入多聚賴氨酸包被的5個六孔板中，隨機分為A、B、C、D、E共5組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待各組細胞融合至80%時，A、B、C、D各組分別加入 GM1濃度為 50μg／mL、100μg／mL、150μg／mL、200μg／mL的誘導液，E組只加入等量 L-DMEM培養(yǎng)基，各組均置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中誘導6h。每1h用倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化1次。

6 誘導細胞的鑒定

于誘導后第6h，用免疫細胞化學染色的方法檢測各組MAP-2、NF-H、GFAP的表達情況，具體方法如下：除去六孔板中的培養(yǎng)液，PBS輕洗一次；4%多聚甲醛室溫固定20秒；PBS洗滌三次；用含0.5%Triton-X 100的 PBS室溫避光破膜 15秒；PBS洗滌三次；加入含3%H2O2的去離子水孵育 5秒；PBS沖洗三次；加入封閉血清工作液，孵育 15秒，倒去，不用洗；按照MAP-2與GFAP（1∶200）、NF-H（1∶200）添加稀釋一抗，4℃過一夜；PBS洗滌三次；添加生物素化的二抗工作液，室溫孵育 15 min；PBS洗滌三次；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育15秒；PBS洗滌三次；新鮮配制的 DAB顯色1秒；蘇木素進行復(fù)染，自來水反復(fù)沖洗。拍照時棄去六孔板中的培養(yǎng)液，PBS輕洗一次；4%多聚甲醛室溫固定20秒；PBS洗滌三次；用含 0.5%Triton-X 100的 PBS室溫避光破膜15秒；PBS洗滌三次；用含2%小牛血清白蛋白的PBS室溫封閉 1h，倒去，不用洗；按MAP-2與GFAP（1∶200）比例、NF-H（1∶200）稀釋壹抗，4℃過一夜；PBS洗滌三次；鋁箔包裹后在 37℃用二抗孵育0.5h以上；吸除二抗，加入 DAPI染色液室溫作用 15秒以上；PBS洗滌三次；熒光顯微鏡下觀察，用合適波段激發(fā)，照相保存結(jié)果。

7 主要觀察指標

①觀察HUMSCs形態(tài)以及生長情況。②觀察HUMSCs表面的標志物表達情況。③觀察細胞誘導分化后的特異性標志物表達情況。

8 神經(jīng)樣細胞特異性標記物的統(tǒng)計

顯微鏡下各組隨機取12個非重疊視野，計算神經(jīng)樣細胞數(shù)，采用社會科學統(tǒng)計程序 19.0版，計量數(shù)據(jù)以±s表示。

結(jié) 果

1 各組中神經(jīng)樣細胞的形態(tài)及數(shù)量變化

按1∶1將神經(jīng)細胞傳代，1d后多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，呈三角或菱形，2d后細胞開始增多并呈長梭形，7d后80%細胞開始融合，細胞按照漩渦或放射狀排列。誘導后1h，各組均可見部分細胞胞體收縮為橢圓狀，兩端伸出突起，呈紡錘樣，以D組神經(jīng)樣細胞數(shù)量最多，A組最少；第2、3h各組神經(jīng)樣細胞數(shù)量逐漸增加，突起伸長，以 D組比率最高；第4h時，A、B、C組神經(jīng)樣細胞數(shù)繼續(xù)增加，表現(xiàn)為雙極或多極細胞，以雙極細胞為主，D組神經(jīng)樣細胞開始脫落，比率不再增加；第 5h時，A、B組神經(jīng)樣細胞增加不明顯，可見部分細胞脫落，C組神經(jīng)樣細胞數(shù)目最多，也伴隨少量細胞脫落，D組神經(jīng)樣細胞呈片狀脫落，比率明顯下降；第 6h時，A、B組神經(jīng)樣細胞不再增加，C組神經(jīng)樣細胞未見明顯變化，D組只有少量沒有脫落的神經(jīng)樣細胞；E組細胞誘導前后的形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。圖 1為觀察到的雙極細胞。

2 免疫細胞化學檢測神經(jīng)細胞特異性標志物

選擇 P2、P5以及 P10代的細胞利用流式細胞技術(shù)進行細胞表面分子標志物檢測，結(jié)果顯示細胞均表達CD73、CD90以及CD105，同時發(fā)現(xiàn)細胞不表達CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR（MHC-II）。經(jīng)6 h不同濃度的 GM1誘導后，多數(shù)神經(jīng)樣細胞的NF-H、MAP-2出現(xiàn)黃綠色熒光，為陽性，GFAP為陰性；而對照組并未出現(xiàn)陽性表達，且 PBS組也為陰性。其中箭頭所指的細胞即為神經(jīng)樣細胞，多為雙極細胞。A、B、C、D組細胞中表達的 NF-H及MAP-2均高于 E組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且C組神經(jīng)樣細胞抗原表達率最高。表1為根據(jù)熒光顯微鏡觀察后所統(tǒng)計的數(shù)據(jù)。

表1 不同質(zhì)量濃度 GM1誘導液誘導 HUMSCs 6h后神經(jīng)樣細胞抗原表達率的比較

討 論

MSCs通常是中胚層的成體干細胞中起源，并從骨髓、胎盤以及臍帶血等組織中分離而來，具有高度增殖、自我更新以及多向分化的潛力。研究發(fā)現(xiàn)HUMSCs比 MSCs優(yōu)勢有以下幾點：1、臍帶的來源并不受限于倫理學，且成本低；2、HUMSCs具有抑癌性不會導致畸胎瘤發(fā)生，此外HUMSCs還具有低免疫原性，免疫調(diào)節(jié)穩(wěn)定性等，因此具有良好的臨床治療潛力［3］。目前大多數(shù)報道發(fā)現(xiàn) MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病效果令人滿意［4-5］。然而動物實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs移植到損傷神經(jīng)組織后，僅少量分化成神經(jīng)樣細胞［6-7］；體外誘導實驗證實損傷的脊髓組織液僅能低效的誘導 BMSCs分化成神經(jīng)樣細胞［8-9］。因此，尋找能誘導或促 MSCs分化的藥物具有重要意義。本實驗證實了神經(jīng)節(jié)苷脂可以在體外誘導 HUMSCs分化為神經(jīng)樣細胞，并表達神經(jīng)元特異性蛋白：微管結(jié)合蛋白-2、NF-H，但并不表達GFAP。

GS是由親水的單唾液酸的寡糖鏈以及疏水的神經(jīng)酰胺組成含有單唾液酸的鞘糖脂，研究發(fā)現(xiàn)其影響細胞粘附、識別以及的跨膜信息傳導，其機制主要利用多肽生長因子來促進細胞增殖以及成熟。外源性的神經(jīng)節(jié)苷脂通過血腦屏障后促進神經(jīng)元軸索再生形成突觸［10］，從而提高神經(jīng)營養(yǎng)因子對細胞的作用［11］，抑制損傷的神經(jīng)細胞凋亡［12］，保持神經(jīng)干細胞的快速增長［13］。

趙春華等［14］發(fā)現(xiàn)，亞全能干細胞群的亞全能基因組除了原始干細胞表型丟失外，其在胚胎發(fā)育成熟后仍然具有干細胞的作用。在適宜的環(huán)境刺激下，細胞可以進一步分化為各種組織細胞。HUMSCs在 GM1誘導下可以激活神經(jīng)細胞特異性的表達，促使HUMSCs分化成神經(jīng)細胞，其激活的機制可能為：①對 HUMSCs的跨膜離子流產(chǎn)生影響，Ca2＋作為細胞內(nèi)信息傳遞的第二信使，其在細胞內(nèi)外的濃度變化以及跨膜流動受到 Ca2＋-ATP酶的調(diào)節(jié)并可引起不同生物學效應(yīng)。崔文［15］等人的研究表明，外源性的 GM3對 Ca2＋-ATP酶有雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度抑制，高濃度激活。劉云云［16］等人發(fā)現(xiàn)，Ca2＋螯合劑川芎嗪可以抑制胞內(nèi)Ca2＋信號，增加NSE和Nurrl基因的表達，最終促使 HUMSCs分化為神經(jīng)細胞。由此可以推斷 150μg／mL GM1誘導液是否抑制了HUMSCs細胞膜上的 Ca2＋-ATP酶，從而減少了細胞內(nèi) Ca2＋的濃度，進而影響了跨膜信號的傳遞，導致一些神經(jīng)元特異基因的表達，最終促使HUMSCs向神經(jīng)細胞分化；②對神經(jīng)生長因子的作用，GM1可以促進 NGF的產(chǎn)生［17］，高濃縮的神經(jīng)營養(yǎng)因子培養(yǎng)液模擬了胚胎發(fā)育階段神經(jīng)發(fā)生的微環(huán)境，在神經(jīng)營養(yǎng)因子作用下，上調(diào) MSC膜蛋白表達，其中TrkA、TrkB、TkrC和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體結(jié)合后可以重拍基因表達程序［18］，讓 MSC分化為神經(jīng)細胞。③影響神經(jīng)突出，GM1通過激活細胞膜表面的異位蛋白激酶，傳遞信號至胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)突起的生長以及延長。

目前，神經(jīng)節(jié)苷脂作為一種神經(jīng)營養(yǎng)藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)于臨床并發(fā)揮了治療作用，但 GM1能否在體內(nèi)將移植的HUMSCs有效地誘導為神經(jīng)細胞并發(fā)揮作用還待于進一步的研究證實。

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（楊 歡 張增武編輯）

Differentiation of Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells into Neuron Like Cells in Vitro Induced by GM1

MA Yan，GUO Jin-yao，LIU Lei，F(xiàn)AN Chun
（General Hospital of Huabei Petroleum Administration，Renqiu 062552，China）

ObjectiveTo study the monosialo four hexose ganglioside（GM1）induced human umbilical cord mesenchymal stem cells into neuron like cells and to explore the optimal concentration in vitro.MethodsThe umbilical cord，umbilical artery and umbilical vein were collected from the healthy fetus in full term pregnancy.The MSCs was obtained by enzyme digestion method and the cell phenotype was determined by flow cytometry.After amplification，the fourth generation cells were divided into A，B，C，D，E five groups.The first 4 groups were the experimental groups，E as control group.The experimental group cells were treated with different concentrations of GM1，group A 50μg／mL，B 100μg／mL group and C group 150μg／mL group D 200μg／mL.Inducing medium was diluted by L-DMEM，the control group was only treated with L-DMEM medium.The morphology of 5 groups was observed and compared every 60 min.At 360 min，the expression of glial fibrillary acidic protein（GFAP）and neurofilament protein（neurofilaments protein H，NF-H）and neuron specific markers of microtubule-associated protein 2（MAP-2）was examined by immunohistochemistry，and calculate the rate of positive cells.ResultsMost of the primary cells were adherent at 9h after inoculation.The cells evolved from polygonal and diamond shapes to spindle shape，and then into spiral and radial shape.Expression of CD105 and CD73，but not HLA-DR，CD90，CD19，CD11b，CD45，CD34，and P3 were detected by flow cytometry.The molecular markers of P5 and P10 on cell surface were detected by flow cytometry.At 360th minutes after induction，the cells of the experimental group were found to be neuron like cells，which showed that the cell bodies were contracted into oval shape，extending out longer processes，and the bipolar cells were the majority.The expression of NF-H and MAP-2 were detected in the experimental group，whereas GFAP was negative.NF-H and MAP-2 in C group（150μg／mL）was at highest rate.Conclusionmonosialo four hexose ganglioside，GM1 can induce umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into neuron like cells.The concentration of 150μg／mL was the most appropriate induction dose.

Monosialo four hexose ganglioside； Human umbilical cord mesenchymal stem cells；Differentiation； Euron like cells

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.030

2016-10-27；

2016-11-21