顏文輝 馬杰

MMP21 MMP28與胃癌進(jìn)展及不良預(yù)后的相關(guān)性研究

顏文輝 馬杰

目的觀察人胃癌組織MMP21和MMP28的表達(dá)，探討其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化法檢測436例胃癌組織和92例癌旁胃組織MMP21和MMP28的表達(dá)，分析其與胃癌進(jìn)展及不良預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果在胃癌組織中，MMP21、MMP28的陽性檢出率分別為31.9%（139/436）和34.4%（150/436）；而92例癌旁胃組織中，MMP21、MMP28均為陰性。在胃癌組織中，MMP21和MMP28的陽性表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度、血管侵襲、淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)?？偵媛试陉栃曰颊弑汝幮曰颊叩?。Cox多因素分析表明在胃癌患者中MMP21、MMP28是生存的獨(dú)立預(yù)測因素。結(jié)論MMP21、MMP28與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，其可能成為新的、獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

MMP21 MMP28 胃癌 TMA 腫瘤進(jìn)展 預(yù)后

胃癌是全世界最常見腫瘤之一，在所有癌癥病死率排名中位居第二，尤其在東亞和中國。因此，闡明胃癌病理機(jī)制并探尋有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)和新的治療策略意義重大。人基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）包括膠原酶型（MMP-1，-8和-13），明膠酶型（MMP-2和-9），間質(zhì)溶解素型（MMP-7和-26）和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶型（MMP-14，-15，-16，-17，-24和-25）以及其他基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-19，-20，-21，-23和-28）。目前研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，MMP-2，MMP-21，MMP-9，MMP-3，MMP-7和MMP-13的過表達(dá)與腫瘤侵襲性相關(guān)［1-3］。但MMP21和 MMP28在胃癌中表達(dá)情況和作用尚無詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究胃癌中MMP21和MMP28的表達(dá)情況，并探討其臨床特征和胃癌總體生存率的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2003年1月至2008年1月浙江省人民醫(yī)院胃癌組織標(biāo)本436例及癌旁組織標(biāo)本92例。男311，女125例；年齡17～91歲（平均年齡60歲），且術(shù)前未進(jìn)行放化療。所有原發(fā)腫瘤標(biāo)本的組織形態(tài)學(xué)均經(jīng)蘇木精-伊紅染色病理組織鏡檢證實(shí)。性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期臨床參數(shù)收集后制成資料庫（見表1）。從診斷到死亡或最后1次隨訪計(jì)算總生存期，通過電話訪問和問卷調(diào)查的形式，每3個(gè)月更新1次隨訪信息，死亡患者由家屬和備案材料證實(shí)，隨訪5年。本項(xiàng)目經(jīng)浙江省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 通過免疫組化對正常胃黏膜和胃癌中MMP21、MMP28的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。組織切片（4μm）經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。切片浸入枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)3min；每張切片加1滴3%H2O2，孵育15min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；1%牛血清白蛋白孵育阻斷非特異性結(jié)合。切片沖洗，用兔抗MMP21單抗（PBS稀釋250倍；ab52817，Abcam，Cambridge，USA）和兔抗MMP28單抗（PBS稀釋250倍；ab155507，Abcam，Cambridge，USA）染色，4℃過夜。正常山羊血清作為陰性對照組。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20min。最后，DAB顯色，切片用蘇木精復(fù)染。每張切片由2名病理科醫(yī)師分別計(jì)數(shù)，并進(jìn)行免疫組化評(píng)估。通過觀察在光學(xué)顯微鏡下的平均信號(hào)強(qiáng)度（0～3等級(jí)）和陽性細(xì)胞百分比（0：＜5%；1：5%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：76%～100%）評(píng)估每張切片的免疫反應(yīng)水平。積分為強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)記分之和：0～3分為陰性，4～12分為陽性［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)。生存曲線用K-M法評(píng)估，并用log-rank檢驗(yàn)計(jì)算曲線間的差異。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。使用Pearson相關(guān)分析方法估計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)和臨床病理結(jié)果之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 436例胃癌患者，并根據(jù)WHO胃癌組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，其中乳頭狀腺瘤16例、管狀腺瘤326例、黏液腺瘤29例和印戒細(xì)胞癌65例。高分化13例、中分化128例、低分化293例、未分化2例。根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)、I期90例、II期104例、III期173例、IV期69例。血管侵犯253例、無血管侵犯183例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移270例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移166例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移61例、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移375例。

2.2 MMP21、MMP28在胃癌中表達(dá)的臨床病理學(xué) 通過觀察436例患者標(biāo)本中MMP21、MMP28陽性染色情況表明，黃棕色顆粒主要位于胃癌細(xì)胞胞漿，而在正常胃上皮細(xì)胞中染色陰性（見圖1、2）。胃黏膜固有層細(xì)胞中檢出的陽性染色為非特異性染色，不進(jìn)行染色評(píng)估。在胃癌組織中，MMP21、MMP28的陽性檢出率分別為31.9%（139/436）和34.4%（150/436），而正常胃組織樣本中MMP21、MMP28染色均為陰性。Cox多因素分析表明在胃癌患者中TNM分期、Lauren分型及MMP21和MMP28表達(dá)為獨(dú)立預(yù)后因子。因此，在胃癌患者中MMP21和MMP28是生存的獨(dú)立預(yù)測因素。見表1、2。

表1 胃癌患者M(jìn)MP21、MMP28表達(dá)陽性的相關(guān)因素［n（%）］

表2 Cox回歸分析

2.3 MMP21、MMP28過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān) 260例胃癌患者M(jìn)MP21、MMP28表達(dá)陰性；113例MMP21、MMP28表達(dá)均陰性。MMP21、MMP28之間有明顯相關(guān)性（r=0.675，P＜0.001）。在436例胃癌患者中，MMP21陽性患者的中位生存時(shí)間較MMP21陰性患者明顯縮短［（27.95±1.19）個(gè)月：（50.42±0.86）個(gè)月，P＜0.001］；MMP21陽性患者5年生存率較MMP21陰性患者明顯縮短（7.9%，11/139：56.2%，167/297，P＜0.001）。同樣，MMP28陽性患者的中位生存時(shí)間較MMP21陰性患者明顯縮短［（29.06±1.27）個(gè)月：（50.73±0.85）個(gè)月，P＜0.001］；MMP28陽性患者5年生存率較MMP28陰性患者明顯縮短（9.3%，14/150：57.3%，164/286，P＜0.001）。在436例胃癌患者中，MMP21和MMP28均陽性患者的中位生存時(shí)間較陰性患者明顯縮短［（27.65±1.31）個(gè)月：（52.87±0.77）個(gè)月，P＜0.001］。

圖1 MMP21在胃癌組織芯片中的免疫組化表達(dá)

圖2 MMP21在胃癌組織芯片中的免疫組化表

3 討論

手術(shù)切除是進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性胃癌最有效的治療方法，但約40%的患者在根治性術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，在胃癌治療中，預(yù)測患者預(yù)后十分必要，故需找到一個(gè)更敏感的預(yù)后指標(biāo)。

多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在炎癥、黏膜創(chuàng)面愈合和腫瘤研究中有被報(bào)道。MMP28（上皮水解素）和MMP21是目前最新被克隆的人體基質(zhì)金屬蛋白酶，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。MMP21是一種分子量為57kD的具有蛋白轉(zhuǎn)化酶活性的MMP。不同于其他包含10個(gè)外顯子的MMP基因，MMP21基因只包含7個(gè)外顯子。MMP21在人體多種惡性腫瘤如Merkel細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和肝癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)［5-10］。MMP28是一種分子量為59 kD的蛋白，包含一個(gè)信號(hào)肽序列、前肽區(qū)、鋅離子結(jié)合催化活性區(qū)及C末端血紅素結(jié)合蛋白樣域。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚基底層、睪丸和肺中，MMP28 mRNA水平最高；在口腔鱗狀細(xì)胞癌和食管癌細(xì)胞中，MMP28表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致錨著獨(dú)立性生長能力下降［11］。也有證據(jù)表明，通過激活TGF-β可誘導(dǎo)肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［12］。

據(jù)報(bào)道，許多轉(zhuǎn)錄因子能與MMP21的啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)合，例如Sp-1、Tcf-4、Pax、Notch、維甲酸受體結(jié)合位點(diǎn)、Smad3及AP-1 recognition motifs［13］。啟動(dòng)子區(qū)包含一個(gè)保守GT盒，能與Sp1/Sp3蛋白（特異性蛋白1、3）結(jié)合，這在基因的基礎(chǔ)表達(dá)中必不可少。這些轉(zhuǎn)錄因子和GT盒參與許多調(diào)控細(xì)胞的生長、周期及腫瘤進(jìn)展的基因表達(dá)。與其他主要表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶不同，MMP21的表達(dá)主要局限于上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，這表明，在癌癥進(jìn)展中，MMP21具有多種調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。因此，探討MMP21在胃癌中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值是有意義的。

本資料中，MMP21和MMP28表達(dá)水平升高，其檢出率分別為31.9%和34.4%。MMP21和MMP28的高表達(dá)與腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這表明MMP21和MMP28參與細(xì)胞外基質(zhì)的分解，在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。從I期～I(xiàn)V期胃癌，MMP21和MMP28表達(dá)逐漸增高，這也表明MMP21和MMP28在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。而兩者與性別、年齡、lauren分型、組織類型、分化程度無關(guān)。更重要的是，K-M生存分析顯示MMP21高表達(dá)的患者總生存期更低；MMP21和MMP28陽性患者比雙陰性或單陰性患者的中位生存時(shí)間明顯縮短。Cox回歸分析表明，在436例胃癌患者中，Lauren分型、TNM分期及MMP21的表達(dá)為獨(dú)立預(yù)后因素。其機(jī)制可能與細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)MMP21和來誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)—降解IV、V、VII、IX和X型變性膠原或調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、腫瘤進(jìn)展。

這些數(shù)據(jù)表明，MMP21和MMP28的表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，且為獨(dú)立預(yù)后因素。其有望成為胃癌TNM分期系統(tǒng)外的另一個(gè)有用的預(yù)后指標(biāo)，并可能通過此指標(biāo)識(shí)別有可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，判斷是否需要積極輔助化療。

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ObjectiveTo observe the expression of MMP21 and MMP28 in gastric cancer tissues，and explore their relationship with clinical pathological feature and prognosis.MethodsThe expression was detected by immunohistochemical in 436 cases of gastric carcinoma and 92 cases of adjacent gastric tissue with MMP21 and MMP28，and we analyzed their correlation with the progression and poor prognosis of gastric cancer.ResultsThe positive rate of MMP21 and MMP28 in gastric cancer tissues was 31.9%（139/436）and 34.4%（150/436）；but they were negative in 92 cases of adjacent normal gastric tissues. The positive expression of MMP21 and MMP28 related to tumor size，infi ltration depth，lymph vascular invasion，node metastasis and TNM staging. The total survival rate in positive patients lower than negative patients. Cox multivariate analysis showed that MMP21 and MMP2 were independent predictors of survival in patients with gastric cancer.ConclusionMMP21 and MMP28 closely contact with invasion，metastasis and prognosis，and they may become new and independent prognostic indicators in gastric cancer.

MMP21 MMP28 Gastric cancer TMA Tumour progression Prognosis

317500 浙江省溫嶺市中醫(yī)院病理科（顏文輝）

310014 浙江省人民醫(yī)院病理科（馬杰）