賈根來(lái) 成翔 朱學(xué)芳 張鵬 陳長(zhǎng)兵

層粘連蛋白配體及其受體在大鼠星形細(xì)胞及挫傷腦細(xì)胞中表達(dá)差異

賈根來(lái) 成翔 朱學(xué)芳 張鵬 陳長(zhǎng)兵

目的觀察層粘連蛋白配體（LN）與層粘連蛋白受體（LN-R）mRNA在大鼠星形細(xì)胞（Astrocyte）和挫傷腦細(xì)胞（Cell of TBI）之間表達(dá)的差異，探討術(shù)中是否應(yīng)盡量保存腦組織。方法從SD大鼠大腦皮層中培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)腦挫傷細(xì)胞（取自SD大鼠挫傷腦組織）。分別提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法，分析LN和LN-R mRNA在大鼠星形細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞中表達(dá)的差異。結(jié)果RT-PCT檢測(cè)，大鼠星形細(xì)胞組和挫傷細(xì)胞組中均表達(dá)LN與LN-R mRNA，而挫傷腦細(xì)胞組中表達(dá)的LN和LN-R mRNA明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 大鼠星形細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞中LN及LN-R表達(dá)存在明顯差異，考慮與誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化等有關(guān)。重型顱腦外傷手術(shù)中，在無(wú)明顯出血的情況下，應(yīng)盡量保留挫傷腦組織。

層粘連蛋白配體 層粘連蛋白受體 星形膠質(zhì)細(xì)胞 挫傷腦細(xì)胞

本系列課題已做的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，作者證實(shí)LN配體及其受體表達(dá)升高，可能與誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移有關(guān)［1］。2013年8月至2015年5月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，觀察LN配體及其受體在大鼠腦挫傷細(xì)胞中是否表達(dá)上調(diào)，并在RNA水平進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 （1）星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：選用成熟SD大鼠，夾取大腦皮層組織約50mg，放入CMF-Hanks液中洗滌、靜置，用0.125%的胰蛋白酶液消化并吹打；15%小牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心后孵育。待細(xì)胞貼壁后，加入4%多聚甲醛1ml固定30min，0.01M PBS洗滌3次，每次10min。含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01M PBS液在37℃條件下孵育封閉10min。加一抗（小鼠抗GFAP IgG1，按1：500倍稀釋），放入4℃冰箱過(guò)夜，洗去一抗，用0.01M PBS洗滌3次，10min/次。加入二抗（FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，按1：200倍稀釋），避光，在37℃水浴箱內(nèi)孵育30min，吸去二抗，洗滌3次，10min/次。在激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm，濾色光波長(zhǎng)為520nm的共聚焦顯微鏡下觀察照相。（2）大鼠挫傷腦細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代：采用美國(guó)AmScien Instruments公司FP302型顱腦液壓損傷裝置，參照顱腦液壓損傷（FPI）模型制備方法，造成大鼠左側(cè)顱腦損傷。沖擊后損傷皮質(zhì)均立即出現(xiàn)明顯血腫，表明模型制備成功。取大鼠挫傷腦細(xì)胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6d，隔日換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)分別接種在2個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的大鼠挫傷細(xì)胞用作提取蛋白。

1.2 RT-PCR（1）大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞RNA的提?。焊魅?×107的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞至1.5ml微量離心管中，加入1ml Trizol試劑裂解，再加入氯仿200μl并振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000r/min，離心15min。將上層水相吸出，加異丙醇500μl。靜置10min。4℃離心，12000r/min，離心10min。棄上清液后加75%乙醇1ml洗滌沉淀。4℃離心，7000r/min，離心5min。棄凈上清液，室溫晾干沉淀。加入20μl RNase-free ddH2O，65℃水浴助溶15min。（2）紫外吸收法測(cè)定總RNA定量：采用紫外分光光度法測(cè)定RNA含量并鑒定RNA純度，RNA濃度計(jì)算公式為：RNA（mg/ml）=40×OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)（n）/1000。（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（第一鏈cDNA合成）：操作步驟：在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 2μg，然后依次加入下列試劑：2.0μl 10mol/L Oligo dT15；10×PCR buffer 2.0μl；2.0μl 5mmol/L dNTPmix；Reverse Transcriptase 1.0μl（4U/μl）。加入適量的DEPC-treated H2O使總體積為20μl。輕柔混勻，37℃孵育60min。④于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。⑤將管插入冰中，加入TE 40μl，輕柔混勻，稍離心。（4）引物設(shè)定：本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物采用在線軟件Primer 3.0，由上海博亞公司合成。引物名稱、序列見表1。

表1 引物名稱、序列

（5）擴(kuò)增LN配體 及其受體：在0.2ml PCR專用Ep管中進(jìn)行，在冰上依次加入下列試劑：2μl cDNA范本、2.5μl 10×PCR buffer、1.5μlMgCl2、1.0μl dNTPmix（2mmol/L）、0.5μl［Lama1上游引物（10μmol/L）、0.5μl Lama1 下游引物 （10μmol/L）］/［Rpsa上游引物（10μmol/L）、0.5μl Rpsa下游引物 （10μmol/L）］、0.5μl Taq酶（2U/μl）、16.5μl ddH2O，最后補(bǔ)至20μl；設(shè)置內(nèi)參組（GAPDH）片段的PCR擴(kuò)增條件為：大鼠脊髓總RNA RT產(chǎn)物（第一鏈）1μl，10×PCR Buffer 2.5μl；MgCl2（25mmol/L）2.0μl；dNTPmix（2mmol/ L）2μl；GAPDH上游引物、下游引物各1μl（10μmol/ L）；Taq DNA聚合酶0.3μl；ddH2O 16.2μl；總體積25μl；溫和混勻后離心。94℃，預(yù)變性5min；94℃，變性30s；56℃，退火30s；72℃，延伸40s。循環(huán)26次。最后72℃延伸7min。（6）PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：在擴(kuò)增DNA的Ep管中，每管取5μl，加入6×loading buf 1μl，混勻，離心，加入載樣孔，行1.5%瓊脂糖凝膠100V電泳約15min，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。紫外燈下觀察并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以目的基因mRNA和內(nèi)參GAPDH mRNA含量的比值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，反復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用PD Quest軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析，采用stata 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞相應(yīng)RT-PCR電泳條帶相對(duì)吸光度值進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和GFAP免疫熒光檢測(cè) 見圖1、2。

2.2 總RNA的檢測(cè) 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞與挫傷腦細(xì)胞總RNA經(jīng)甲醛變性膠電泳、EB染色，28S和18S條帶清晰可見，5S條帶隱約可見，提示RNA未降解。OD260/OD280為1.90，表明RNA純度滿意。見圖3。

2.3 LN 及其受體表達(dá)電泳 分別將大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞總RNA經(jīng)甲醛變性膠電泳、EB染色，GAPDH為對(duì)照，可見挫傷腦細(xì)胞中LN配體及其受體表達(dá)較星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加。見圖4。

2.4 LN及其受體表達(dá)變化分析 將RT-PCR電泳OD相對(duì)值（目的基因OD值/內(nèi)參OD值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)挫傷腦細(xì)胞LN配體及其受體表達(dá)量與星形膠質(zhì)細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5、6。

圖1 從SD大鼠大腦皮層中分離、培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP-FITC，Common Focus （Bar=50μm）

圖2 實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的大鼠挫傷腦細(xì)胞（Bar=50μm）

圖3 總RNA電泳圖

圖4 LN及其受體表達(dá)電泳

圖5 LN配體表達(dá)變化分析

圖6 LN受體表達(dá)變化分析

3 討論

Ajioka I等［2］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，LN是最有利于人NSC遷移的底物。Flanagan等［3］通過(guò)活體外NSC在四種不同的底物（多聚-L-鳥氨酸，纖維連接蛋白，層粘連蛋白，基質(zhì)膠）上的遷移，以及其不同反應(yīng)，觀察到LN能加強(qiáng)NSC的遷移，分化，延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間。表明LN及其integrin受體是人類NSC重要的調(diào)節(jié)因子。Tate［4］通過(guò)腹前腦生殖區(qū)分離神經(jīng)節(jié)隆起祖細(xì)胞（geNPC），成人紋狀體祖細(xì)胞，并做體外培養(yǎng)，分析在不同ECM底物上的粘附、遷移和分化能力。發(fā)現(xiàn)，geNPC在LN上，其粘附和遷移能力明顯加強(qiáng)。

重型腦外傷患者，特別是對(duì)沖性腦挫裂傷手術(shù)患者，可能在術(shù)后出現(xiàn)遲發(fā)性血腫。部分血腫較大，甚至形成腦疝，危及生命，影響患者的預(yù)后，需再次手術(shù)治療［5］，有時(shí)會(huì)造成醫(yī)患矛盾。多數(shù)認(rèn)為，再次出血的原因較多，醫(yī)源性的因素是包括初次手術(shù)止血不嚴(yán)格，也可能與腦挫傷失活組織再次滲血相關(guān)［6］。有學(xué)者認(rèn)為，挫傷腦組織完全失活，無(wú)組織學(xué)活性。且可能成為術(shù)后再出血的根源，引發(fā)醫(yī)患矛盾。因此，手術(shù)中，應(yīng)將挫傷腦組織完全清除［7］。但術(shù)中挫傷腦組織清除過(guò)多，即使是部分“功能啞區(qū)”組織清除，也可能對(duì)患者的預(yù)后形成影響。加大癡呆，癲癇，昏迷等并發(fā)癥的發(fā)生幾率［8-9］。

在本實(shí)驗(yàn)中，作者提取大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和挫傷腦細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，證實(shí)挫傷腦細(xì)胞表達(dá)高水平的LN及LN-R。結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，建議重型顱腦外傷的手術(shù)中，在無(wú)明顯活動(dòng)性出血的情況下，應(yīng)該盡量保留挫傷腦組織，避免過(guò)度清除挫傷的腦組織。

［1］高宜錄,張鵬,劉梅. 層粘連蛋白受體與配體在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及意義.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,27(6)：844-847.

［2］Ajioka I,Jinnou H,Okada K,et al. Enhancement of neuroblast migration into the injured cerebral cortex using laminin-containing porous sponge. Tissue Eng Part A,2015,21(1-2)：193-201.

［3］Flanagan LA, Rebaza LM, Derzic S, et al. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res,2006, 83(5)： 845-56.

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［5］陸健,利文倩,黃國(guó)洲,等. 重型顱腦損傷二次手術(shù)原因及效果分析. 中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué),2010,9(3)：848-850.

［6］董建平,羅志偉,王和平,等. 神經(jīng)外科開顱術(shù)后再次手術(shù)26例臨床分析. 昆明醫(yī)學(xué)院報(bào),2011,12(9)：127-128.

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ObjectiveTo investigate the mRNA differential expression of Laminin （LN） and its receptor LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI and explore the necessity of preservation of brain tissue around the injured cortex on operation. Method Isolated and cultured rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI respectively. Total RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR） method was used in detection of the expression change of LN and LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI.ResultsLN and LN-R mRNA were expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. The mRNA expression level of LN and LN-R of rat cells around the injured cortex area after TBI were higher than these of rat astrocytes，the difference was signifi cant，P＜0.05.ConclusionLN and LN-R differentially expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. We speculated this phenomenon was involved in biological process of the migration and differentiation of neural stem cells. During the operation of severe craniocerebral trauma，in the absence of obvious hemorrhage，brain tissue should be reserved as much as possible.

Laminin Laminin receptor Astrocytes Cells of traumatic brain injury

2014年江蘇省如皋市科技局科技立項(xiàng)課題(HS149130)

226500 江蘇省如皋市人民醫(yī)院（賈根來(lái) 朱學(xué)芳 張鵬 陳長(zhǎng)兵）

226001 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖實(shí)驗(yàn)室（成翔）