胡丹丹 畢爽 姜遠英 王彥

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

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·論著·

紫檀茋誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的研究

胡丹丹 畢爽 姜遠英 王彥

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的 探究紫檀茋 (Pterostilbene，PTE)誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的活性。方法 通過分析白念珠菌凋亡細胞、壞死細胞和活細胞比例，檢測Caspase酶活性、細胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位，評價PTE誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的活性。結(jié)果 ≥4 μg/mL PTE處理后白念珠菌凋亡比例明顯增加，Caspase酶活性顯著升高，細胞內(nèi)活性氧水平顯著升高，線粒體膜電位顯著降低。結(jié)論 PTE具有誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的活性，該作用可能與活性氧積累和線粒體損傷相關(guān)。

白念珠菌；紫檀茋；細胞凋亡

[Chin J Mycol，2016，11(2):75-78]

白念珠菌是臨床常見的條件致病真菌，能引起人類淺表和系統(tǒng)性感染，免疫功能低下人群更為易感，已成為重癥監(jiān)護患者死亡的最重要的直接原因之一，同時也是引發(fā)血管導(dǎo)管相關(guān)感染的第四大原因和導(dǎo)尿管相關(guān)感染的第三大原因[1-3]。臨床可用的抗真菌藥物品種非常有限，而且白念珠菌耐藥的問題日益凸顯，研發(fā)新機制的抗真菌藥物迫在眉睫。紫檀茋 (Pterostilbene，PTE)是一種存在于多種天然植物中的茋衍生植物抗毒素，有研究報道其能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PTE具有抑制白念珠菌生物被膜的作用。在本研究中我們觀察了PTE對白念珠菌凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314由美國華盛頓喬治敦大學(xué)William A.Fonzi教授饋贈。

藥物 PTE由中科院廣州化學(xué)研究所合成。黃芩素 (Baicalein，BE)和法尼醇 (Farnesol)均從Sigma-Aldrich公司購買。

試劑 Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit，購于凱基生物科技。CaspSCREENTMFLow Cytometric Apoptosis Detection Kit，購于BioVision。DCFH-DA試劑盒，購于碧云天。JC-1熒光染料，購于Molecular Probes?。磷酸鹽緩沖溶液 (Phosphate Buffered Saline，PBS)(0.8%NaCl，0.04%KCl，0.0133%Na2HPO4，0.006%KH2PO4，0.035%NaHCO3)。

培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨及2%葡萄糖)。SDA固體培養(yǎng)基 (1%蛋白胨、4%葡萄糖及2%瓊脂)。

實驗儀器 HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠。FACSCalibur流式細胞儀，美國。TECAN Infinite M200多功能酶標(biāo)儀，瑞士。

1.2 方法

菌株培養(yǎng) 從4℃保存的SDA固體培養(yǎng)基上挑取白念珠菌SC5314單克隆中于YPD液體培養(yǎng)基，在30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化16 h后用于實驗。

PTE處理后凋亡細胞、壞死細胞和活細胞比例分析[5]實驗選擇BE和Farnesol作為誘導(dǎo)細胞凋亡的陽性藥物與PTE進行比較，使用Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit檢測。白念珠菌于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長期 (OD600=0.5)，分別用不同劑量的PTE、BE和Farnesol處理3 h。處理后，將菌細胞 (1×105)用500 μL Binding Buffer重懸，并順序加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide (PI)。充分混合，25℃下避光孵育15 min，然后通過流式細胞儀檢測分析，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

Caspase酶活性檢測[6]使用CaspSCREENTM Flow Cytometric Apoptosis Detection Kit檢測Caspase酶活性。白念珠菌培養(yǎng)同上，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106CFU/mL，然后用不同劑量的PTE、BE和Farnesol處理3 h。藥物處理后，將細胞用PBS洗滌3次。用0.3 mL的Incubation Buffer重懸細胞至1×105CFU/mL，水浴加熱至37℃，然后加入3 μL濃度為1 mol/L的DTT (使終濃度為10 mmol/L)和1 μL的D2R reagent。37℃下避光孵育10～20 min。然后使用流式細胞儀檢測熒光信號，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

細胞內(nèi)活性氧 (ROS)含量檢測[7]使用DCFH-DA試劑盒對細胞內(nèi)ROS含量進行測定。白念珠菌培養(yǎng)同上，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106CFU/mL，然后用不同劑量的PTE、BE和Farnesol處理3 h。藥物處理后，將細胞用PBS洗滌3次，并重懸至1×107CFU/mL。加入DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L，37℃下孵育20 min，離心取100 μL上清液至平底微孔板 (96孔，透明)。使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm。

線粒體膜電位檢測[5,7]白念珠菌培養(yǎng)至指數(shù)生長期 (OD600=0.5)，然后用不同劑量的PTE、BE和Farnesol處理3 h。藥物處理后，將細胞用PBS洗滌3次，并重懸至1×106CFU/mL。用10 μg/mL的JC-1染料處理，37℃下避光孵育20 min后，將細胞用PBS洗滌2次，并濃縮為100 μL轉(zhuǎn)移至黑色96孔微孔板。使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長從綠色 (～525 nm)至紅色 (～590 nm)。線粒體膜電位由紅色與綠色熒光的比值來確定。

1.3 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5對全部數(shù)據(jù)進行分析，采用t檢驗方法比較兩組間均數(shù)，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTE誘導(dǎo)白念珠菌細胞發(fā)生凋亡

空白組正常凋亡細胞約占3%，用PTE處理白念珠菌3 h，4 μg/mL的PTE即可誘導(dǎo)14%的白念珠菌發(fā)生凋亡，當(dāng)劑量增至8 μg/mL或16 μg/mL時，凋亡細胞比例約17%。實驗過程中我們將已報道有誘導(dǎo)白念珠菌凋亡活性的黃芩素 (BE)和法尼醇 (Farnesol)作為陽性對照藥物[8-9]，4 μg/mL的BE和Farnesol誘導(dǎo)白念珠菌細胞凋亡的比例分別為18%和20% (見圖1)。

2.2 PTE處理后白念珠菌Caspase酶活性升高

Caspase是真核細胞凋亡過程中一類重要的酶[10]，其活性可作為檢測細胞凋亡的指標(biāo)，通過檢測熒光信號確定細胞D2R染色率，可反映出細胞內(nèi)Caspase酶活性。白念珠菌經(jīng)PTE處理3 h后，2 μg/mL處理組細胞染色率為12.10%，與對照組沒有顯著差異。4 μg/mL、8 μg/mL和16 μg/mL處理組細胞染色率分別為69.70%、72.34%和74.70%，與0 μg/mL的空白對照組相比，細胞Caspase酶活性皆顯著升高 (P<0.001)。作為陽性對照的4 μg/mL BE處理組和Farnesol處理組，細胞染色率分別為76.07%和74.55% (P<0.001)(見圖2)。

2.3 PTE處理后白念珠菌細胞內(nèi)ROS積累

細胞凋亡可能觸發(fā)線粒體膜超極化，細胞內(nèi)ROS增加[11]，因此我們利用熒光試劑DCFH-DA檢測了PTE處理后白念珠菌細胞內(nèi)ROS含量的變化。與0 μg/mL的空白對照組相比，4 μg/mL PTE處理組細胞內(nèi)ROS的水平顯著增加 (P<0.01)，約為空白對照組的2倍。8 μg/mL和16 μg/mL PTE處理組ROS水平升高更為明顯 (見圖3)。

2.4 PTE處理后白念珠菌線粒體膜電位降低

線粒體膜通透性增加被普遍認為是細胞凋亡的標(biāo)志之一[11]。我們應(yīng)用熒光試劑JC-1檢測了線粒體膜電位。PTE處理3 h后，2 μg/mL處理組與對照組相比線粒體膜電位沒有明顯變化。4 μg/mL及更高濃度的PTE處理組膜電位顯著降低至約0 μg/mL空白對照組的一半 (P<0.05)，與BE和Farnesol陽性對照藥組相近 (見圖4)。

圖1 PTE處理3 h后白念珠菌凋亡、壞死和活細胞比例 圖2 PTE處理3 h后對白念珠菌Caspase酶活性的影響 (與對照組相比，***P<0.001) 圖3 PTE處理3 h后對白念珠菌細胞內(nèi)ROS水平的影響 (與對照組相比，**P<0.01) 圖4 PTE處理3 h后對白念珠菌線粒體膜電位的影響 (與對照組相比，*P<0.05)

Fig.1 The percentages ofC.albicanscells that are apoptotic (black bars) and necrotic (white bars) after exposure to different concentrations of PTE for 3 h Fig.2 The Caspase activity ofC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h Fig.3 ROS levels inC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h.The ROS level was presented by fluorescence intensity Fig.4 Mitochondrial membrane potential ofC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h.Mitochondrial membrane potential assay was determined by the ratio of red to green fluorescence intensity

3 討 論

細胞凋亡是細胞自主有序的死亡，是生物體普遍存在的過程[12]。誘導(dǎo)或促進細胞凋亡目前已成為抗腫瘤的治療策略[5]，對我們抗真菌方面的研究有一定的借鑒意義，誘導(dǎo)病原真菌的凋亡可能成為抗真菌的新策略。

PTE是一種茋類化合物，提取自小漿果如藍莓、葡萄等，具有抗炎、抗氧化、降血糖和降血脂等多種生物學(xué)活性[6]，可以作為保健品使用[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)PTE具有抑制癌細胞增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡的作用[13-14]，且實驗證明，PTE不影響大鼠L6成肌細胞和大鼠皮膚成纖維細胞的增殖[13]?？梢姡琍TE作為藥物安全性很高。

我們前期報道了PTE抑制白念珠菌生物被膜的活性[15]，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，PTE可以誘導(dǎo)白念珠菌發(fā)生細胞凋亡。本研究中選取BE和Farnesol作為陽性對照藥物，前期報道證實，二者在4 μg/mL時均具有誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的作用[8-9]。

為深入研究PTE誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的作用，我們測試了一系列細胞凋亡相關(guān)的指標(biāo)。我們首先分析了凋亡細胞、壞死細胞和活細胞的比例，這是檢測細胞凋亡最直接的方法。結(jié)果揭示了PTE誘導(dǎo)白念珠菌細胞凋亡的活性。之后，我們檢驗了Caspase酶活性和線粒體功能相關(guān)指標(biāo)。Caspase是一類半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，該酶被激活后通過切割蛋白來傳遞蛋白水解級聯(lián)信號，引發(fā)細胞凋亡過程[10,16-17]。本研究中使用的D2R通過被Caspase分解釋放出綠色熒光物質(zhì)，因此被用于考察Caspase酶的活性。研究結(jié)果顯示，PTE誘導(dǎo)的白念珠菌細胞凋亡過程確與Caspase依賴性通路相關(guān)。前人在模式生物釀酒酵母中的研究表明線粒體介導(dǎo)細胞凋亡的Caspase通路，當(dāng)?shù)蛲鲂盘柗肿幼饔糜诰€粒體時，線粒體通透性改變，膜電位降低，線粒體解偶聯(lián)，產(chǎn)生大量ROS，隨之細胞凋亡過程啟動[18-20]。在本研究中，PTE在4 μg/mL時誘導(dǎo)凋亡作用明顯，與4 μg/mL BE和Farnesol相當(dāng)，但當(dāng)PTE濃度進一步升高時，誘導(dǎo)凋亡作用并未顯著增強。PTE處理后白念珠菌線粒體膜電位降低，細胞內(nèi)ROS水平升高，該結(jié)果提示，PTE誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的過程同樣與線粒體損傷相關(guān)。

綜上所述，本研究首次報道了PTE能夠誘導(dǎo)白念珠菌凋亡，該過程與線粒體損傷相關(guān)。通過藥物誘導(dǎo)白念珠菌凋亡可能為抗真菌藥物研發(fā)提供新思路。PTE生物安全性高，應(yīng)用前景廣泛，PTE能夠誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的發(fā)現(xiàn)對新型抗真菌藥物研發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

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[本文編輯] 施 慧

Pterostilbene induces apoptosis inCandidaalbicans

HU Dan-dan,BI Shuang,JIANG Yuan-ying,WANG Yan

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To explore the activity of Pterostilbene (PTE) in inducing apoptosis ofCandidaalbicans.Methods We used apoptosis,necrosis and overall viability assays,caspase activity determination,ROS measurement and mitochondrial membrane potential assay to evaluate the activity of PTE in inducing apoptosis ofC.albicans.Results AfterC.albicanstreated with ≥4 μg/ml PTE,the percentage of apoptosis cells and activity of Caspase notably increased.Moreover,the mitochondrial membrane potential decreased significantly and the intracellular ROS increased.Conclusions PTE has an apoptosis-inducing effect onC.albicans,and this effect may be associated with ROS accumulation and mitochondrial injure.

Candidaalbicans;pterostilbene;apoptosis

國家自然科學(xué)基金 (81273558,81072678)；上海市浦江人才計劃 (14PJD001)

胡丹丹，女 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:dandanhu1989@163.com；畢爽，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:shuangxun640@126.com

王彥,E-mail:wangyansmmu@126.com;姜遠英，E-mail:jiangyuanying@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0075-04

2015-10-08