吳偉偉 王千 龔杰 萬喆 王愛平 李若瑜

(北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

?

·論著·

不同分數(shù)抑菌濃度解讀標準評估抗真菌藥物體外聯(lián)合效應比較

吳偉偉 王千 龔杰 萬喆 王愛平 李若瑜

(北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

目的 明確酮康唑聯(lián)合特比萘芬或萘替芬相互作用模式，評估不同分數(shù)抑菌濃度解讀標準對判斷抗真菌藥物體外聯(lián)合效應的影響。方法 參考CLSI微量液基稀釋法M27-A3和M38-A2方案，采用棋盤微量稀釋法對100株分離自臨床真菌病患者的菌株進行酮康唑與特比萘芬或奈替芬體外聯(lián)合藥敏試驗，包括皮膚癬菌，念珠菌和馬拉色菌。采用不同分數(shù)抑菌濃度解讀標準評估酮康唑與特比萘芬或奈替芬體外聯(lián)合效應，A標準定義為：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用；B標準:FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用；C標準：FICI<1為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=1為相加作用，12為拮抗作用。結果 A標準與B標準具有較好的一致性，C標準則較為寬松。根據(jù)C標準進行解讀會明顯擴大協(xié)同效應范圍。結論 定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標準，具有簡便、一致性好的優(yōu)點，值得臨床采用。

抗真菌藥物；聯(lián)合；藥敏實驗；分數(shù)抑菌濃度

[Chin J Mycol，2016，11(2):85-89]

近年來隨著真菌感染臨床病例不斷增多及抗真菌藥物的廣泛應用，真菌對抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象，特別是唑類藥物的耐藥現(xiàn)象也日漸嚴重，而抗真菌藥物的開發(fā)卻相對緩慢，因此抗真菌藥物聯(lián)合應用則為真菌病患者提供了更多的治療選擇。臨床實踐表明抗真菌藥物聯(lián)合應用確實可對部分單一藥物治療無效的患者取得良好效果[1-4]，但如何選擇合適的抗真菌藥物進行聯(lián)用是臨床醫(yī)師面臨的難題。棋盤法是最為常用的體外測定抗真菌藥物聯(lián)合效應的方法，分數(shù)抑菌濃度 (fractional inhibitory concentration index,FICI)則是最為常用解釋抗真菌藥物相互作用的模型，但其自身也存在缺點，如長期以來不同文獻對于FICI自身解讀尚存在多種標準[5-8]。酮康唑、特比萘芬和萘替芬是唑類和丙烯胺類抗真菌藥物的典型代表，臨床廣泛應用，但酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合用藥的實驗資料極為有限。因此，為明確酮康唑與特比萘芬或萘替芬的聯(lián)合應用價值，并評價不同分數(shù)抑菌濃度解讀標準對抗真菌藥物聯(lián)合效應評估的影響，我們根據(jù)CLSI M38-A2[9]和M27-A3[10]方案，采用棋盤微量稀釋法對近期國內臨床分離到的100株真菌病患者致病菌株 (皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌)進行酮康唑與特比萘芬或萘替芬體外聯(lián)合藥敏實驗，并采用不同分數(shù)抑菌濃度判斷標準進行聯(lián)合效應評估。

1 材料和方法

1.1 受試菌株

100株受試真菌系北京大學真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分離自臨床真菌病患者，均經(jīng)形態(tài)學和核糖體內轉錄間隔區(qū) (ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region)序列分析鑒定，其中包括皮膚癬菌屬45株 (紅色毛癬菌20株，趾間毛癬菌10株，絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌各5株)，念珠菌屬40株 (白念珠菌25株，光滑念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌各5株)，馬拉色菌屬15株 (糠秕馬拉色菌12株，厚皮馬拉色菌3株)。質控菌株為美國菌種保藏中心提供的近平滑念珠菌ATCC-22019和紅色毛癬菌ATCC-MYA-4439。

1.2 抗真菌藥

酮康唑、特比萘芬和萘替芬，均為標準試劑級粉劑。酮康唑購自Sigma-Aldrich公司 (St.Louis,USA，批號為SLBK7327V)，特比萘芬和萘替芬購自中國食品藥品檢定研究院 (北京，中國，批號分別為100563-201402，100823-20501)。

1.3 培養(yǎng)基

皮膚癬菌和念珠菌培養(yǎng)基使用RPMI-1640液體培養(yǎng)基，稱取34.53 g MOPS (三氮嗎啡啉丙璜酸)和10.4 g RPMI-1640，加900 mL蒸餾水溶解后用pH計調整pH至7.0，定容至1 000 mL，過濾除菌并置于4℃儲存?zhèn)溆?。馬拉色菌培養(yǎng)基使用Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基和改良Leeming-Nortman液態(tài)培養(yǎng)基。Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基包含1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛膽汁鹽、0.1%甘油、0.05%單硬脂酸甘油酯、2%橄欖油、0.05%吐溫-60、1%全脂牛奶、1.2%瓊脂、0.5%放線菌酮和0.05%氯霉素[11]。改良Leeming-Nortman液態(tài)培養(yǎng)基包含0.1%葡萄糖、0.1%蛋白胨、0.8%牛膽汁鹽、0.2%酵母浸膏、0.1%甘油、0.5%吐溫-60、3%橄欖油和50 μg/mL氯霉素[12]。

1.4 真菌藥敏試驗

藥物儲存液制備 采用100%二甲基亞砜 (DMSO)溶解稀釋3種抗真菌藥物至儲存液濃度為1.6 mg/mL，置于無菌聚乙烯小瓶-70℃存儲備用。

藥敏板制備 實驗前使用RPMI-1640或改良Leeming-Nortman液體培養(yǎng)基將3種藥物儲存液進行倍比稀釋，獲得4倍于終濃度的藥液。藥敏板第1列與第H行相交孔 (即左下角孔)為生長對照孔，第1列及第H行 (除生長對照孔外)為單藥藥敏試驗區(qū)，第2～11列及A～G行交集處為聯(lián)合藥敏試驗區(qū)，第12列為空白對照孔。采用棋盤法，將稀釋后藥液分別加入到96孔藥敏板 (12×8)中，取酮康唑、特比萘芬或萘替芬各稀釋濃度藥液50 μL依次加入A～G行或1～11列各孔。使得皮膚癬菌時，酮康唑最終濃度范圍為0.03～2 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.000 25～0.125 μg/mL；念珠菌時，酮康唑最終濃度范圍為0.015～8 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.125～8 μg/mL；馬拉色菌時，酮康唑最終濃度范圍為0.004～2 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.5～32 μg/mL。藥敏板制備密封后置于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液制備 ①試驗前將受試皮膚癬菌菌株接種在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)上30℃培養(yǎng)4～5 d使其活化。取1 mL無菌0.85%鹽水覆蓋菌落，輕輕用移液器尖端摩擦菌落制成菌懸液。將菌懸液吸至無菌試管中靜置10 min，取上清液振蕩15 s，血細胞計數(shù)器計數(shù)孢子，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基調整為終濃度菌懸液 (1～3)×103CFU/mL。②試驗前將受試念珠菌菌株在沙氏固體培養(yǎng)基 (SDA)上連續(xù)轉種2次，以保證其純度和活力，隨后35℃培養(yǎng)24 h；將受試馬拉色菌菌株接種在Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，第2次32℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)4 d。從培養(yǎng)基中挑取5個大約1 mm的菌落，用5 mL無菌0.85%鹽水混懸。震蕩15 s，混勻菌懸液。在530 nm波長的比濁儀上，用無菌0.85%鹽水調整菌懸液到0.5個麥氏比濁度。震蕩混勻菌懸液，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基或改良Leeming-Nortman液體培養(yǎng)基調整為終濃度菌懸液 (0.5～2.5)×103CFU/mL。

菌懸液接種 試驗當天向已制備好的藥敏板每孔各加入100 μL稀釋好的2倍于終濃度的菌懸液 (空白對照孔除外)。

培養(yǎng) 接種后的藥敏板置于濕盒內，皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌分別在35℃培養(yǎng)5～7 d、48 h和3～5 d。每天觀察生長情況，以陽性對照孔生長良好為準。

結果判讀 按照CLSI M27-A3和M38-A2制定的標準進行結果判讀。只有當生長對照生長良好且質控菌株最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentrations，MIC)值在規(guī)定范圍內時，方認為試驗成功，可進行結果判讀。所有試驗均進行2次。同一菌株MIC值在2次試驗不超過2個稀釋度時認為相同。MIC判讀標準均定為與生長對照相比生長明顯抑制 (80%)的最低藥物濃度。

1.5 聯(lián)合用藥效果評價

采用分數(shù)抑菌濃度 (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)表示，即聯(lián)合用藥時藥物的MIC值分別除以單獨用藥時藥物MIC值的商之和，表示為：FICI=MIC A聯(lián)合/MIC A單獨+MIC B聯(lián)合/MIC B單獨。

藥物之間的相互作用解釋為：A標準:FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用[6]。B標準:FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用[7]。C標準：FICI<1為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=1為相加作用，12為拮抗作用[8]。

2 結 果

酮康唑與特比萘芬或萘替芬體外藥敏實驗聯(lián)合效應分析詳見表1和表2。根據(jù)A標準或B標準對聯(lián)合藥敏結果進行解讀可得到較為一致的結果：酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用對各種皮膚癬菌，均未顯示出明顯協(xié)同效應；酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對白念珠菌表現(xiàn)為明顯協(xié)同效應，對熱帶念珠菌和近平滑念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同效應，對光滑念珠菌無協(xié)同作用；酮康唑與萘替芬聯(lián)用對近平滑念珠菌顯示部分協(xié)同效應，對白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌無明顯協(xié)同作用。酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對兩種馬拉色菌均表現(xiàn)出明顯協(xié)同效應，酮康唑與萘替芬聯(lián)用對糠秕馬拉色菌無明顯協(xié)同作用，對厚皮馬拉色菌則表現(xiàn)為部分協(xié)同效應。根據(jù)C標準則可解讀為：酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用對各種皮膚癬菌均顯示出部分協(xié)同效應。酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對白念珠菌和近平滑念珠菌表現(xiàn)為明顯協(xié)同效應，對光滑念珠菌和熱帶念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同效應。酮康唑與萘替芬聯(lián)用對近平滑念珠菌顯示明顯協(xié)同效應，對白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同作用。酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用均對兩種馬拉色菌均表現(xiàn)出明顯協(xié)同效應。

3 討 論

近年來研究表明，單獨長期應用抗真菌藥物可能導致真菌產生耐藥性[13-14]，而多種不同作用機理抗真菌藥物聯(lián)合可能通過增強藥物各自抗菌活性，減少各自用量以及各自不同作用部位藥效累積作用，從而增強療效，同時減少或延遲耐藥的產生[15-16]。唑類藥物和丙烯胺類藥物分別作用于真菌麥角固醇合成的不同靶點，故聯(lián)用時可能發(fā)揮協(xié)同效應。多項實驗研究已經(jīng)證實特比萘芬與唑類藥物聯(lián)用可產生協(xié)同作用[17-20]，但關于酮康唑與特比萘芬或萘替芬的聯(lián)合體外藥敏研究資料仍然很少。

目前聯(lián)合藥敏實驗FICI自身解讀存在多種標準，其中對于協(xié)同和拮抗效應的定義較為一致。協(xié)同效應為兩種藥物聯(lián)合應用時產生的積極相互作用，發(fā)揮大于各自效應單純相加所產生的抑制效應。拮抗則為兩種藥物聯(lián)合應用時產生的消極相互作用，顯著低于藥物單獨檢測時的抑制效應。但對于“無相互作用”的定義則存在爭議，諸如“相加”“無關”“獨立”和“自主”等仍然被廣泛使用。然而，許多已經(jīng)發(fā)表用于確定抗真菌藥物相互作用的標準過于寬松，導致協(xié)同或拮抗效應的臨床相關性存在不確定性。除此以外，絕大多數(shù)關于抗菌劑聯(lián)合效應的報告將無相互作用分為兩類，即相加和無關，則使得相互作用的解釋更為復雜。當聯(lián)合應用的效果為所檢測藥物單獨效應之和時可定義為相加，而無關則表示為聯(lián)合效應僅僅表現(xiàn)為兩種藥物中較為有效藥物的效應。目前而言，絕大多數(shù)學者認為在相加和無關之間并無實質性不同，主張當FICI值略微高于或低于1.0的理論臨界值時，實際上預示著藥物間并無相互作用[21]。因此，定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標準較為普遍接受。

表1 酮康唑與特比萘芬體外藥敏實驗聯(lián)合效應分析

表2 酮康唑與萘替芬體外藥敏實驗聯(lián)合效應分析

本研究結果顯示，對A標準與B標準而言，酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合，對不同菌種的抗菌協(xié)同和拮抗效應比例均無改變，A標準中無相互作用比例為B標準中相加與無關比例之和；對于C標準而言，酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合，對不同菌種的抗菌拮抗效應無改變，而抗菌協(xié)同效應比例較A標準與B標準明顯增加。根據(jù)C標準進行解讀則會明顯擴大抗菌協(xié)同效應。因此，采用A標準對抗真菌藥物體外聯(lián)合抗菌效應結果進行解讀可能更為合理。

綜上所述，本研究表明不同F(xiàn)ICI解讀標準對抗真菌藥物體外聯(lián)合抗菌效應評估可產生不同的解讀結果，定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標準，則具有簡便、一致性好的優(yōu)點，值得臨床采用。

致謝 本研究由西安楊森制藥有限公司贊助。

[1] Hosokawa K,Yamazaki H,Mochizuki K,et al.Successful treatment ofTrichosporonfungemiain a patient with refractory acute myeloid leukemia using voriconazole combined with liposomal amphotericin B[J].Transpl Infect Dis,2012,14(2):184-187.

[2] Ogawa T,Takezawa K,Tojima I,et al.Successful treatment of rhino-orbital mucormycosis by a new combination therapy with liposomal amphotericin B and micafungin[J].Auris Nasus Larynx,2012,39(2):224-228.

[3] Zhang J,Xi L,Lu C,et al.Successful treatment for chromoblastomycosis caused byFonsecaeamonophora:a report of three cases in Guangdong,China[J].Mycoses,2009,52(2):176-181.

[4] Bhat SV,Paterson DL,Rinaldi MG,et al.Scedosporiumprolificansbrain abscess in a patient with chronic granulomatous disease:successful combination therapy with voriconazole and terbinafine[J].Scand J Infect Dis,2007,39(1):87-90.

[5] Berenbaum MC.A method for testing for synergy with any number of agents[J].J Infect Dis,1978,137(2):122-130.

[6] Li Y,Wan Z,Li R.Invitroactivities of nine antifungal drugs and their combinations againstPhialophoraverrucosa[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(9):5609-5612.

[7] Tamura T,Asahara M,Yamamoto M,et al.Invitrosusceptibility of dermatomycoses agents to six antifungal drugs and evaluation by fractional inhibitory concentration index of combined effects of amorolfine and itraconazole in dermatophytes[J].Microbiol Immunol,2014,58(1):1-8.

[8] Nguyen MH,Barchiesi F,McGough DA,et al.Invitroevaluation of combination of fluconazole and flucytosine againstCryptococcusneoformansvar.neoformans[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(8):1691-1695.

[9] Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi;Approved Standard,2nd ed.CLSI document M38-A2[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne,PA,2008.

[10] Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts;Approved Standard,3rd ed.CLSI document M27-A3[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne,PA,2008.

[11] Leeming JP,Notman FH.Improved methods for isolation and enumeration ofMalasseziafurfurfrom human skin[J].J Clin Microbiol,1987,25(10):2017-2019.

[12] Miranda KC,de Araujo CR,Costa CR,et al.Antifungal activities of azole agents against theMalasseziaspecies[J].Int J Antimicrob Agents,2007,29(3):281-284.

[13] Evans EG.Resistance ofCandidaspecies to antifungal agents used in the treatment of onychomycosis:a review of current problems[J].Br J Dermatol,1999,141(Suppl 56):33-35.

[14] Czaika V,Tietz HJ,Schmalreck A,et al.Antifungal susceptibility testing in chronically recurrent vaginal candidosis as basis for effective therapy[J].Mycoses,2000,43( Suppl 2):45-50.

[15] Gupta AK,Kohli Y.Invitrosusceptibility testing of ciclopirox,terbinafine,ketoconazole and itraconazole against dermatophytes and nondermatophytes,andinvitroevaluation of combination antifungal activity[J].Br J Dermatol,2003,149(2):296-305.

[16] Cuenca-Estrella M.Combinations of antifungal agents in therapy--what value are they?[J].J Antimicrob Chemother,2004,54(5):854-869.

[17] Yu J,Li R,Zhang M,et al.Invitrointeraction of terbinafine with itraconazole and amphotericin B against fungi causing chromoblastomycosis in China[J].Med Mycol,2008,46(7):745-747.

[18] Zhang X,Huang H,Feng P,et al.Invitroactivity of itraconazole in combination with terbinafine against clinical strains of itraconazole-insensitiveSporothrixschenckii[J].Eur J Dermatol,2011,21(4):573-576.

[19] Scheid LA,Mario DA,Kubica TF,et al.Invitroactivities of antifungal agents alone and in combination against fluconazole-susceptible and -resistant strains ofCandidadubliniensis[J].Braz J Infect Dis,2012,16(1):78-81.

[20] Ahmed SA,Kloezen W,Fahal AH,et al.Invitrointeraction of currently used azoles with terbinafine againstMadurellamycetomatis[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(2):1373-1374.

[21] Odds FC.Synergy,antagonism,and what the chequerboard puts between them[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(1):1.

Comparision of different interpretation criterions of fractional inhibitory concentration for evaluating theinvitrocombined effect of antifungal agents

WU Wei-wei,WANG Qian,GONG Jie,WAN Zhe,WANG Ai-ping,LI Ruo-yu

(DepartmentofDermatologyandVenereology，PekingUniversityFirstHospital，ResearchCenterforMedicalMycology，PekingUniversity，Beijing100034，China)

Objective To determine the interaction pattern of ketoconazole combined with terbinafine or naftifine,and to evaluate the effects of different interpretation criterions of fractional inhibitory concentration index (FICI) for theinvitrocombined effect of antifungal drugs.Methods According to CLSI M38-A2 and M27-A3,a checkerboard broth microdilution method was performed to investigate theinvitroactivities of ketoconazole in combination with terbinafine or naftifine against 100 clinical strains isolated from patients with mycosis,including dermatophyte,CandidaandMalassezia.Different criterion for the interpretation of fractional inhibitory concentration were employed to evaluate theinvitrocombined effect of ketoconazole in combination with terbinafine or naftifine.Standard A:synergy is defined by FICI≤0.5,antagonism by FICI>4,and no interaction by FICI>0.5,but≤4;Standard B:synergy is defined by FICI≤0.5,additive by FICI>0.5,but≤1,no interaction by FICI>1,but≤2,and antagonism by FICI>2;Standard C:synergy is defined by FICI≤1,additive by FICI=1,no interaction by FICI>1,but≤2,and antagonism by FICI>2.Results Standard A had good consistency with Standard B,Standard C is relatively lenient.According to Standard C,the interpretation might significantly expand the range of synergy.Conclusions The interpretation criterion of fractional inhibitory concentration (Synergy is defined by FICI≤0.5,antagonism by FICI>4,and no interaction by FICI>0.5,but≤4) has the advantage of simplicity,convenience and good consistence,and it is worthy of clinical application.

antifungal agents;combination;susceptibility testing;fractional inhibitory concentration

吳偉偉，男 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:vigorwu@126.com

李若瑜，E-mail:mycolab@126.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0085-05

2015-09-08 [本文編輯] 王 飛