李娟 陳敏 潘搏 雷文知 方文捷 劉加 洪南 李穎芳 廖萬清 潘煒華

(上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍皮膚病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

?

·論著·

一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理的組織胞漿菌分子診斷技術(shù)

李娟 陳敏 潘搏 雷文知 方文捷 劉加 洪南 李穎芳 廖萬清 潘煒華

(上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍皮膚病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

目的 研發(fā)一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)原理的組織胞漿菌感染的分子診斷技術(shù)。方法 以組織胞漿菌為研究對(duì)象，針對(duì)其種特異性的M抗原基因序列，設(shè)計(jì)并篩選數(shù)套基于LAMP技術(shù)的特異性引物，同時(shí)優(yōu)化其反應(yīng)條件，建立一種針對(duì)組織胞漿菌感染的快速分子鑒定技術(shù)。結(jié)果 該LAMP技術(shù)在65℃、90 min反應(yīng)條件下，對(duì)組織胞漿菌基因組DNA的檢測敏感度達(dá)到5.3 pg/反應(yīng) (即5.3×10-12g，約160個(gè)基因組DNA拷貝)，且與其相近種屬真菌無交叉反應(yīng)。結(jié)論 我們研發(fā)的這種基于LAMP技術(shù)原理的組織胞漿菌分子診斷技術(shù)具有操作簡便、特異性及敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，具有臨床推廣應(yīng)用的潛力。

組織胞漿菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；分子診斷；快速檢測

[Chin J Mycol，2016，11(2):79-84]

組織胞漿菌病 (histoplasmosis，HP)是人類被莢膜組織胞漿菌 (Histoplasmacapsulatum)感染所引起的侵襲性真菌病。該病目前有全球性分布趨勢，臨床表現(xiàn)不典型，尤以進(jìn)行性播散性組織胞漿菌病 (progressive disseminated histoplasmosis，PDH)最為危重，預(yù)后兇險(xiǎn)[1-2]。莢膜組織胞漿菌屬雙相型真菌，目前的真菌分類學(xué)研究將其劃分為3個(gè)變種：莢膜組織胞漿菌莢膜變種 (Histoplasmacapsulatumvar.capsulatum)，又稱美洲型莢膜組織胞漿菌；莢膜組織胞漿菌杜氏變種 (Histoplasmacapsulatumvar.duboisii)，又稱非洲型莢膜組織胞漿菌；馬皮疽莢膜組織胞漿菌 (Histoplasmacapsulatumvar.farciminosum)[3]。累及人類導(dǎo)致侵襲性感染的主要是莢膜組織胞漿菌莢膜變種 (Histoplasmacapsulatumvar.capsulatum)與莢膜組織胞漿菌杜氏變種 (Histoplasmacapsulatumvar.duboisii)。以往的研究多認(rèn)為該病是一種地方性真菌病，主要流行于美洲 (主要是北美大陸)[3]，非洲及亞洲等地區(qū)偶見報(bào)道，歐洲較少見。但近30 a來，國內(nèi)相關(guān)報(bào)道也呈上升趨勢[4-5]。

目前，臨床明確組織胞漿菌感染的診斷方法主要是培養(yǎng)和血清血試驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且漏診率較高，不能滿足臨床的實(shí)際需要。然而，組織胞漿菌病的臨床預(yù)后與是否能早期明確診斷密切相關(guān)。因此，研發(fā)出快速、特異、易于操作的早期診斷方法，是臨床工作的迫切需求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[6]，具有靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于臨床的HIV、禽流感、結(jié)核等疾病的快速分子檢測。目前，該技術(shù)在病原真菌的分子檢測研究領(lǐng)域則相對(duì)較少。因此，我們決定針對(duì)組織胞漿菌基因組DNA的M抗原基因，研發(fā)一種基于LAMP技術(shù)原理的組織胞漿菌感染的快速分子診斷的技術(shù)方法，為解決臨床相關(guān)需求提供必要的工作基礎(chǔ)及技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株 選用組織胞漿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株6株、實(shí)驗(yàn)室分離株2株，相關(guān)種屬菌株14株，詳見表1。菌株購于荷蘭皇家科學(xué)與藝術(shù)研究院CBS真菌多樣性研究中心 (Centraalbureau voor Schimmelcultures,CBS,Utrecht,The Netherlands)美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物集存中心 (American type culture collection,ATCC,Manassas,Virginia,U.S.A)及第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚病真菌病研究所真菌庫。

表1 LAMP特異性測試 (n=22)

注：P.Positive,陽性反應(yīng);N.Negative,陰性反應(yīng)

培養(yǎng)基及試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為沙保氏培養(yǎng)基 (SDA)、玉米培養(yǎng)基 (CMA)、腦心浸萃血培養(yǎng)基 (BHIB)、梅里埃雙相培養(yǎng)基 (MLI)均購自生工生物工程 (上海)股份有限公司。Loopamp DNA amplification kit、Loopamp Fluorescence Detection Reagent購自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；TIANGEN 2×pfu PCR MasterMix高保真酶購自北京天根生物科技有限公司；DNA Marker (DL2000)購自上海寶生物工程有限公司 (TAKARA)；真菌DNA抽提液：1 mL 1 mol/L Tris-HCl，4 mL 500 mmol/L EDTA，加ddH2O定容至10 mL。引物由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

主要儀器和設(shè)備 Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀 (北京藍(lán)譜生物科技有限公司)，電泳儀 (國產(chǎn)TAN ETS 300)，凝膠成像分析系統(tǒng) (FR-980復(fù)日生物電泳圖像分析系統(tǒng))，Eppendorf Biophotometer分光分度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

靶序列確定 經(jīng)過序列分析，選定組織胞漿菌M抗原基因?yàn)榘行蛄校拿绹鳱CBI Genbank核酸數(shù)據(jù)庫中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)選取一株組織胞漿菌莢膜變種菌株相應(yīng)靶基因序列。

引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PrimerExplorer V4 LAMP引物設(shè)計(jì)程序軟件 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)出M抗原對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)引物，根據(jù)適當(dāng)篩選條件篩選適合的引物如表2。

表2 引物列表

LAMP反應(yīng)體系 將設(shè)計(jì)出的引物分別與模板DNA (組織胞漿菌)按照LAMP反應(yīng)體系加樣，置于Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中反應(yīng)，預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為90 min。LAMP反應(yīng)體系如下：總體積25 μL，包括1 μL FIP (40 μmol/L)、1 μL BIP (40 μmol/L)、1 μL F3 (5 μmol/L)、1 μL B3 (5 μmol/L)、1 μL Loop primer F (20 μmol/L)、1 μL Loop primer B (20 μmol/L)、12.5 μL Buffer 2X、3.5 μL ddH2O、2 μL DNA sample，1 μL Bst DNA Polymerase。可見性反應(yīng)為加入1 μL鈣黃綠素-氯化錳 (Calcein-MnCl2)做指示劑在紫外線下可視化顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]。反應(yīng)結(jié)束后觀察引物反應(yīng)擴(kuò)增曲線，并對(duì)引物進(jìn)行特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)。

待驗(yàn)證菌株培養(yǎng)及全基因組DNA抽提 (1)菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng)：取出-20℃保藏的菌株，置于20℃下復(fù)蘇24 h，使其恢復(fù)繁殖活力，轉(zhuǎn)菌至預(yù)制培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)。取菌株標(biāo)本接種于MLI中，25℃培養(yǎng)，獲單個(gè)菌落后轉(zhuǎn)種SDA、CMA、BHIB各2份，分別于25℃和35℃培養(yǎng)。組織胞漿菌為雙相型真菌，培養(yǎng)時(shí)間較長，通常需要2～6周。酵母相比霉菌相生長慢，且對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求高。(2)氯化芐法[8]抽提組織胞漿菌基因組DNA，并用分光分度計(jì)檢測各菌株基因組DNA及其濃度。

特異性實(shí)驗(yàn)及LAMP可見性實(shí)驗(yàn) (1)將設(shè)計(jì)好的M抗原引物分別與上述步驟已準(zhǔn)備好的各菌株DNA按照LAMP體系，65℃，90 min進(jìn)行反應(yīng)，觀察分別的擴(kuò)增反應(yīng)情況。設(shè)立組織胞漿菌作為陽性對(duì)照，雙蒸水組作為陰性對(duì)照。(2)LAMP凝膠電泳檢查：用HE120電泳儀提供的灌膠模具灌制12 cm×6 cm的1.4%瓊脂糖凝膠，于LAMP管中取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物分別與5 μL Ladder Buffer充分混合后上樣于1.4%的瓊脂凝膠，120 V電壓電泳30 min后取出瓊脂凝膠經(jīng)FR-980復(fù)日生物電泳圖像分析系統(tǒng)拍照。(3)LAMP可見性實(shí)驗(yàn)：配有指示劑的LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管觀察各組顏色變化。

敏感性實(shí)驗(yàn)及LAMP可見性實(shí)驗(yàn) (1)擴(kuò)增曲線：將組織胞漿菌全基因組DNA濃度分別以十倍梯級(jí)稀釋，使DNA含量分別為5.3×10-8g、5.3×10-9g、5.3×10-10g、5.3×10-11g、5.3×10-12g、5.3×10-13g、5.3×10-14g、0 g (ddH2O)。將上述不同濃度梯度的DNA 分別按照LAMP體系，65℃，90 min反應(yīng)，結(jié)束后觀察擴(kuò)增情況。設(shè)立不含DNA組為陰性對(duì)照。(2)LAMP可見性實(shí)驗(yàn)：重復(fù)上述步驟，在配好各組LAMP反應(yīng)體系后，在LAMP管中依次加入1 μL 鈣黃綠素以指示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。65℃ 90 min反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管觀察各組顏色變化。

2 結(jié) 果

2.1 真菌培養(yǎng)

25℃呈菌絲相：SDA及CMA上約2周可形成直徑3～4 mm的白色絨毛狀菌落，背面棕色，不產(chǎn)生紅色色素，未見其滲入培養(yǎng)基現(xiàn)象。35℃呈酵母相：BHIB及MLI上約4周可見直徑3～4 mm的圓形、隆起、光滑、棕黃色菌落。

2.2 特異性結(jié)果

將篩選出的引物分別與各菌株DNA按照LAMP體系進(jìn)行反應(yīng)，觀察分別的擴(kuò)增反應(yīng)情況。具體如表2所示。

菌株凝膠電泳結(jié)果如圖1a所示。由此可知：基于組織胞漿菌M抗原序列設(shè)計(jì)的引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性，除了組織胞漿菌菌株均出現(xiàn)陽性結(jié)果外，其他菌株包括粗球孢子菌、申克孢子絲菌、馬爾尼菲青霉菌、膠囊青霉菌、煙曲霉、雅致鱗質(zhì)霉、鋸形放線菌、絮狀表皮癬菌、白念珠菌、新生隱球菌等均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。初步驗(yàn)證了基于M抗原序列設(shè)計(jì)的LAMP引物具有較好的特異性。

LAMP反應(yīng)后可見性實(shí)驗(yàn)，各管濁度表現(xiàn)結(jié)果見圖1b。根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后LAMP管濁度的變化可以初步判斷是否發(fā)生了擴(kuò)增，如發(fā)生擴(kuò)增，則表示該反應(yīng)管內(nèi)含有目的基因，反之，如反應(yīng)管清亮則表示無監(jiān)測的目的基因，為未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。

2.3 敏感性結(jié)果

不同濃度梯度的DNA與引物反應(yīng)后擴(kuò)增曲線如圖2所示。由圖2a的擴(kuò)增曲線可以看出，基于組織胞漿菌核糖體內(nèi)基因間隔區(qū)M抗原序列的LAMP敏感程度可以達(dá)到5.3 pg (即10-12g)。

菌株凝膠電泳結(jié)果如圖2b所示；不同濃度梯度的組織胞漿菌DNA可見性實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果如圖2c所示。

3 討 論

組織胞漿菌可侵犯全身，最常累及肺，免疫缺陷患者表現(xiàn)為進(jìn)行性播散性感染，死亡率超過90%[9]，延誤PDH的抗真菌治療的死亡率在30%～42%[10-12]。該病臨床易誤診為普通的病毒性或細(xì)菌性肺炎、馬爾尼菲青霉菌病 (penicilliposis marneffei，PM)[13]。故臨床常誤診為細(xì)菌性肺炎病例而予抗菌治療；而馬爾尼菲青霉菌也會(huì)導(dǎo)致致命的播散性感染，且在亞洲多見報(bào)道[14]。雖然組織胞漿菌素皮試有助于慢性患者的診斷，但免疫缺陷者常不出現(xiàn)反應(yīng)，故該試驗(yàn)主要用于流行病調(diào)查。目前，以培養(yǎng)為代表的形態(tài)學(xué)診斷方法仍是臨床上組織胞漿菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長、陽性率低等缺陷并不能符合臨床實(shí)際需求。因此，近年來以核酸檢測為代表的非培養(yǎng)診斷技術(shù)逐漸成為國內(nèi)外侵襲性真菌病早期診斷技術(shù)研究的熱點(diǎn)。

分子生物學(xué)的檢測技術(shù)的快速發(fā)展，各種核酸擴(kuò)增技術(shù)在病原菌檢測方面的研究越來越多。LAMP技術(shù)具備特異性強(qiáng)特點(diǎn)，其中2對(duì)引物針對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)的識(shí)別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性，本研究中包含了組織胞漿菌屬 (n=8)莢膜組織胞漿菌、莢膜組織胞漿菌杜氏變種、馬皮疽莢膜組織胞漿菌3個(gè)變種和相近種屬 (n=14)的粗球孢子菌、副球孢子菌、申克孢子絲菌、馬爾尼菲青霉菌、膠囊青霉菌、皮炎芽生菌、煙曲霉、雅致鱗質(zhì)霉、鋸形放線菌、絮狀表皮癬菌、白念珠菌、克柔念珠菌、新生隱球菌、格特隱球菌菌株，特異性達(dá)100%。而傳統(tǒng)血清學(xué)檢測例如國外常用的ELISA檢測患者血清抗Hc抗體，包被抗原主要有3種:HMIN (莢膜組織胞漿菌素)、pHMIN (純化莢膜組織胞漿菌素)和ptHMIN (處理后的純化莢膜組織胞漿菌素)[15]。但因HMIN含有多種糖抗原決定簇而與多種病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性僅有80%[16-17]。

圖1 凝膠電泳結(jié)果 (a)及LAMP 反應(yīng)后各管濁度表現(xiàn)結(jié)果 (b)，LAMP反應(yīng)體系下表現(xiàn)為陽性樣本顯示熒光綠：從左至右M代表Marker條帶起始處，1～6為組織胞漿菌屬：CBS114.388、CBS215.53、CBS136.72、CBS633.91、CBS205.35、CBS537.84；7～16為相近種屬：CBS144.34、ATCC10268、ATCC201013、CBS134186、ATCC60916、ATCC64704、CBS130793、CBS221.64、ATCC20735、H99 圖2 不同濃度DNA LAMP敏感性擴(kuò)增效率曲線 (a)、擴(kuò)增后電泳圖 (b)及可見性實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果 (c)，陽性樣本顯示熒光綠。其中M代表Marker條帶起始處，1～7為5.3×10-8g、5.3×10-9g、5.3×10-10g、5.3×10-11g、5.3×10-12g、5.3×10-13g、5.3×10-14g，8為ddH2O陰性對(duì)照
Fig.1 After gel electrophoresis (a) and LAMP reaction each tube turbidity performance results (b),under LAMP reaction system performance display positive green fluorescence samples.From left to right：Marker，1 to 6 are Histoplasma：CBS114.388,CBS215.53,CBS136.72,CBS633.91,CBS205.35,CBS537.84；7 to 16 is similar to the species：CBS144.34,ATCC10268,ATCC201013,CBS134186,ATCC60916,ATCC64704,CBS130793,CBS221.64,ATCC20735,H99 Fig.2 Different concentrations of DNA LAMP sensitive amplification efficiency curve (a),after amplification electrophoresis (b) and the visibility of the experimental results of the reaction (c),positive samples showed fluorescent green.From left to right：Marker，5.3×10-8g,5.3×10-9g,5.3×10-10g,5.3×10-11g,5.3×10-12g,5.3×10-13g,5.3×10-14g,ddH2O negative

該LAMP技術(shù)在65℃、90 min反應(yīng)條件下，對(duì)組織胞漿菌基因組DNA的檢測敏感度達(dá)到5.3 pg/反應(yīng) (即5.3×10-12g，約160個(gè)基因組拷貝)，優(yōu)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction，PCR)對(duì)Hc DNA的檢測敏感性 (約300個(gè)基因拷貝)[18]，與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Quantitative Realtime-PCR,qPCR)對(duì)組織胞漿菌的 DNA檢測的敏感性相當(dāng)[19]。但PCR、qPCR需要比Bst聚合酶更貴且不穩(wěn)定的Taq酶和較昂貴的高精度熱循環(huán)儀，在資源受限的國家和地區(qū)很難推廣應(yīng)用。

目前，雖然以核酸檢測技術(shù)為代表的分子檢測技術(shù)尚未成熟，但已經(jīng)凸顯出對(duì)經(jīng)典真菌學(xué)檢測技術(shù)的技術(shù)優(yōu)勢與臨床應(yīng)用潛力。美國HOLOGIC Gen-Probe公司雖早在十余年前就已經(jīng)開發(fā)出了針對(duì)Hc的基因探針測試盒 (The AccuProbe H.capsulatum culture identification test)[20-21]，但是此產(chǎn)品價(jià)格高昂且操作復(fù)雜，即使在美國等發(fā)達(dá)國家也未推廣應(yīng)用，更遑論發(fā)展中國家和地區(qū)。而本研究中開發(fā)的LAMP方法操作簡便，不需要特殊儀器，只需恒溫水浴鍋即可完成整個(gè)反應(yīng)，且特異性可靠、敏感高；結(jié)果鑒定簡明直接，肉眼即可直接觀察結(jié)果，具有較好的開發(fā)潛力和臨床應(yīng)用前景。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

A loop-mediated isothermal amplification method for molecular detection ofHistoplasmacapsulatum

LI Juan,CHEN Min,PAN Bo,LEI Wen-zhi,FANG Wen-jie,LIU Jia,HONG Nan,LI Ying-fang,LIAO Wan-qing,PAN Wei-hua

(ShanghaiKeyLaboratoryofMolecularMedicalMycology，Instituteofdermatologyandfungaldiseases，PLAKeylaboratoryofthefungaldiseases，Departmentofdermatology，Changzhenghospital，Shanghai200003)

Objective To develop a molecular diagnostic approach for the diagnosis ofHistoplasmacapsulatumbased on the LAMP technology.Methods To establish and optimize a specific primer set of the LAMP technology targeting the sequence of M Antigen for rapid and molecular detection ofHistoplasmacapsulatumat species level.Results In our study,no cross-reaction was observed after 90 min of LAMP reaction,including DNA of the phylogenetically related species such asCoccidioidesimmitis,Sporothrixschenckii,Penicilliummarneffei,etc.The limit-of-detection of the LAMP for genomicHistoplasmacapsulatumDNA was approximately 5.3×10-12g per run (approximately 160 genomic copies).Conclusion Our proposed LAMP assay could represent a potential molecular detection tool for rapid diagnosis ofHistoplasmacapsulatumas a point of care test to be used in clinics in the future.

histoplasmosis;loop-mediated isothermal amplification;molecular diagnostics;rapid detection

重大傳染病防治科技重大專項(xiàng) (2013ZX10004612)；國家973項(xiàng)目 (2013CB531601，2013CB531606)；國家自然科學(xué)基金 (81201269)；上海市科委專項(xiàng) (14DZ2272900)

李娟，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:lijuanluck@gmail.com

潘煒華，E-mail:panweihua@medmail.com.cn

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0079-06

2015-12-29