張永萍，徐 劍，吳靜瀾，謝偉杰（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550002）

pH對(duì)吲哚美辛理化性質(zhì)和離體透皮參數(shù)的影響Δ

張永萍＊，徐 劍#，吳靜瀾，謝偉杰（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550002）

目的：研究不同pH對(duì)吲哚美辛理化性質(zhì)和離體透皮參數(shù)的影響。方法：采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析，測(cè)定pH分別為5.0、5.8、6.5、7.3、8.0下吲哚美辛的溶解度、表觀油水分配系數(shù)（Kapp）和吲哚美辛凝膠的離體透皮參數(shù)[滲透速率（Js）和4、12、24 h累積滲透量（Q4h、Q12h、Q24h）]，通過(guò)復(fù)相關(guān)分析法與回歸模型確定pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：吲哚美辛凝膠離體透皮模型符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，pH與溶解度、Kapp具有良好線性模型（r≥0.892 0），相關(guān)性良好（r≥0.968 0）；pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數(shù)之間基本呈指數(shù)模型，以pH 7.3為調(diào)節(jié)臨界點(diǎn)的對(duì)應(yīng)Kapp為3.34。結(jié)論：調(diào)節(jié)pH，可改善吲哚美辛的溶解度與Kapp；調(diào)節(jié)分子-離子存在形式，可提高吲哚美辛的Q和Js。

pH；吲哚美辛；理化性質(zhì)；離體透皮參數(shù)；相關(guān)性

吲哚美辛（Indomethacin），屬于吲哚類生物堿，略顯酸性，按生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）劃分屬于第二類，高滲透性低溶解性；作為非甾體抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛藥，其抗炎、解熱作用明顯，常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；但口服給藥具有嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)，存在神經(jīng)副作用、致腎損傷等問(wèn)題[1-2]。為了減小其毒副作用，對(duì)其經(jīng)皮給藥方法的研究較多?；诖?，本文研究了pH對(duì)吲哚美辛理化性質(zhì)與離體透皮參數(shù)的影響，以期為新型吲哚美辛親水凝膠貼劑的經(jīng)皮給藥開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；TK-12B型透皮擴(kuò)散儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，離心半徑：6.0 cm）。

1.2 藥品與試劑

吲哚美辛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100258-200904，純度：99.9%）；吲哚美辛原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YY-10944，純度：99.5%）；苯扎溴銨（江西德成制藥有限公司，醫(yī)用級(jí)，批號(hào)：20111016）；甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，正辛醇、硫化鈉及其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量為18～25 g，♀♂兼用，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（軍）2012-0011。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3-5]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水（80∶20，V/V），流速：1 ml/min；可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD檢測(cè)器），檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 緩沖液 參考2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則8003項(xiàng)[6]，制備pH分別為5.0、5.8、6.5、7.3、8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS），室溫靜置，貯存，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取吲哚美辛對(duì)照品適量，用pH為7.3的PBS溶解后定容，制備成57.80 μg/ml的吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)需要再稀釋至不同濃度。

2.2.3 供試品溶液 取離體透皮接收液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 取空白凝膠（不含吲哚美辛）的離體透皮接收液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取吲哚美辛對(duì)照品制備成5.78、8.67、11.56、17.34、23.12、28.9、34.68、46.24、57.80 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加樣回收率試驗(yàn) 取對(duì)照品與供試品，分別按相關(guān)規(guī)定考察儀器精密度、24 h樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率。

2.4 溶解度的測(cè)定

參考2015年版《中國(guó)藥典》（四部）凡例中“溶解度試驗(yàn)法”[3]操作。精密稱取過(guò)量吲哚美辛原料藥，置于50 ml量瓶中，加入不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的PBS，在（25±2）℃下電熱恒溫振蕩水槽勻速振蕩4 h，當(dāng)觀察到底部溶質(zhì)有部分不溶物且不再減少時(shí)，認(rèn)為已被飽和溶解；室溫條件靜置2 h后，取上清液2 ml，12 000 r/min離心12 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品。

2.5 表觀油水分配系數(shù)（Kapp）的測(cè)定

采用“搖瓶法”[4-6]。制備不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的含吲哚美辛飽和溶解的PBS，飽和質(zhì)量濃度為c0。分別精密取10 ml含吲哚美辛飽和溶解的PBS，再加入等體積被水飽和的正辛醇，密封口。在（25±2）℃下勻速振蕩24 h，兩相平衡，靜置4 h，取下層含吲哚美辛的PBS 2 ml，12 000 r/min離心12 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品。檢測(cè)其中吲哚美辛的質(zhì)量濃度c水，計(jì)算Kapp，Kapp＝（c0－c水）/c水。

2.6 離體透皮試驗(yàn)

2.6.1 離體皮膚制備與保存 取小鼠脫毛，脫頸部處死，剝?nèi)「共科つw，去除皮下脂肪、血管等附屬組織，置于1‰苯扎溴銨溶液（新潔爾滅）中浸泡30 min防腐，取出后生理鹽水沖洗，加入適量20%甘油，剪成適當(dāng)大小，密封袋包裝，－20℃冷凍保存。

2.6.2 吲哚美辛凝膠制備[7]以明膠2.805 g、聚乙烯醇4.353 g、羧甲基纖維素鈉2.504 g、甘油14.871 g、氧化鋅0.139 g作為凝膠基質(zhì)，分別加不同pH的PBS至100 g，制得載藥量均為12.5 mg的不同pH的吲哚美辛凝膠。

2.6.3 累積滲透量（Q）的測(cè)定 采用Franz裝置[8]，接收池體積7.0 ml，接觸面積2.92 cm2，不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的PBS為接收液，每種接收液重復(fù)6次。將離體皮膚固定，剪去多余的邊緣，精密稱定2.0 g不同pH的吲哚美辛凝膠，緊貼于離體皮膚角質(zhì)層和膜一側(cè)上面，確保無(wú)氣泡存在，頂端用塑料薄膜密封。設(shè)置水浴恒溫為（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min，分別于1、2、4、6、8、10、12、16、24 h精密取樣2 ml，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)pH的等溫等體積PBS，測(cè)定其中吲哚美辛的濃度，計(jì)算Q。Q＝，式中Q為單位面積累積滲透量（μg/cm2），V為接收池體積，A為接收池接觸面積，cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)質(zhì)量濃度，ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)濃度，Vi為接收液體積。繪制離體透皮曲線，采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)曲線進(jìn)行擬合分析，其斜率即為滲透速率（Js）。

2.7 相關(guān)性分析[9-10]

以pH與吲哚美辛溶解度、pH與吲哚美辛Kapp、pH與吲哚美辛離體透皮參數(shù)作變化曲線圖，分析不同pH對(duì)吲哚美辛理化性質(zhì)和離體透皮參數(shù)的影響。采用復(fù)相關(guān)性分析法對(duì)吲哚美辛溶解度、Kapp與pH相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，采用Pearson復(fù)相關(guān)分析法對(duì)溶解度、Kapp、pH與離體透皮參數(shù)相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。各數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 19.0軟件。

2.8 回歸分析[11]

以pH為自變量（X）、溶解度與Kapp為因變量（Y），利用SPSS 19.0進(jìn)行三者線性回歸模型分析。結(jié)合pH表示氫質(zhì)子濃度的指數(shù)形式，對(duì)pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數(shù)采用線性回歸模型分析，無(wú)實(shí)際統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故采用指數(shù)回歸模型進(jìn)行擬合分析；分別以LN（pH）、IN（溶解度）、N（Kapp）為自變量（X），透皮參數(shù)IN（Q）為因變量（Y），采用逐步法進(jìn)行回歸擬合。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

吲哚美辛的出峰時(shí)間約為8 min，陰性樣品對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾；吲哚美辛的回歸方程為y＝23.594x+1.22（r＝0.999 6），檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為5.78～57.80 μg/ml；儀器精密度、24 h樣品穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)的峰面積RSD依次為0.23%、1.24%、2.57%（n＝6）；加樣回收率為99.8%，RSD＝0.18%（n＝6）。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

3.2 溶出度與Kapp檢測(cè)結(jié)果

不同pH下吲哚美辛的溶解度和Kapp的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 不同pH下吲哚美辛的溶解度和Kapp的檢測(cè)結(jié)果（n＝3）Tab 1 The solubility and Kappof indomethacin at different pH values（n＝3）

3.3 離體透皮參數(shù)檢測(cè)結(jié)果

24 h內(nèi)吲哚美辛凝膠的離體透皮符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，r≥0.992 0，屬于控釋釋放制劑。不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮曲線見圖2，不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果見表2。

圖2 不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮曲線（n＝6）Fig 2 The transdermal curves of indomethacin at different pH values in vitro（n＝6）

表2 不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（n＝6）Tab 2 The transdermal parameters of indomethacin at different pH values in vitro（n＝6）

3.4 相關(guān)性分析結(jié)果

（1）當(dāng)pH為5.0～8.0時(shí)，隨pH升高，吲哚美辛的溶解度呈一定指數(shù)曲線模型增加；當(dāng)pH大于7.3后，溶解度的增加幅度（斜率）變大。pH與溶解度存在正向線性相關(guān)（r＝0.892 0）。（2）pH與Kapp存在負(fù)向線性相關(guān)（r＝－0.893 0）。（3）當(dāng)pH為5.0～7.3時(shí)，隨pH升高，吲哚美辛凝膠的Js、Q4h、Q12h、Q24h均呈一定線性增加；當(dāng)pH大于7.3后則逐漸減小，說(shuō)明pH 7.3為吲哚美辛的pH調(diào)節(jié)臨界點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的Kapp＝3.34。pH、Kapp與吲哚美辛凝膠離透皮參數(shù)存在良好相關(guān)性，其他參數(shù)相關(guān)性不顯著。不同pH下吲哚美辛溶解度、Kapp和吲哚美辛凝膠離體透皮參數(shù)變化的曲線見圖3。pH、溶解度、Kapp、離體透皮參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果見表3。

圖3 不同pH下吲哚美辛溶解度、Kapp和吲哚美辛凝膠離體透皮參數(shù)變化的曲線Fig 3 The curves for solubility and Kappof indomethacin and in vitro transdermal parameters of Indomethacin gel at different pH values

表3 pH、溶解度、Kapp、離體透皮參數(shù)相關(guān)性分析Tab 3 The correlation among pH，solubility，Kappand in vitro transdermal parameters

3.5 回歸分析結(jié)果

溶解度、Kapp與pH具有良好線性回歸模型，r≥0.892 0。各自變量與離體透皮參數(shù)間指數(shù)回歸模型擬合性基本良好，排除部分干擾因素，pH-溶解度、pH-Kapp、pH-Q24h、pH-Js、溶解度-Q24h、溶解度-Js均呈現(xiàn)較好指數(shù)關(guān)系模型，r≥0.8，P≤0.05。溶解度、Kapp與pH的線性回歸模型分析結(jié)果見表4，溶解度、Kapp、pH、離體透皮參數(shù)的線性回歸模型分析結(jié)果見表5。

表4 溶解度、Kapp與pH的線性回歸模型分析結(jié)果Tab 4 Analysis of regression model for solubility and Kappat different pH values

表5 溶解度、Kapp、pH、離體透皮參數(shù)的線性回歸模型分析結(jié)果Tab 5 Analysis of regression model for solubility，Kapp，pH and in vitro transdermal parameters

4 討論

BCS是基于藥物體外溶解性與腸道滲透性兩方面對(duì)藥物進(jìn)行分類而形成的分類系統(tǒng)。除了皮膚屏障作用外，藥物自身理化性質(zhì)，包括溶解性、分子態(tài)、晶型等，對(duì)透皮特性產(chǎn)生重要影響，此對(duì)應(yīng)藥物的溶解性與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性，可用于指導(dǎo)經(jīng)皮給藥制劑設(shè)計(jì)。

由于吲哚美辛具有良好的脂溶性，幾乎不溶于水，且顯酸性，酸度系數(shù)為4.5。根據(jù)BCS，通過(guò)調(diào)節(jié)pH的手段改善吲哚美辛分子-離子存在形式，以改變其溶解度；根據(jù)Fick定律，提高透皮擴(kuò)散皮膚兩側(cè)濃度差ΔC（即為dC/dx），可提高透皮動(dòng)力，一定范圍內(nèi)能提高吲哚美辛的透皮效果。但由于皮膚主要屏障結(jié)構(gòu)（角質(zhì)層），主要由類脂和角質(zhì)蛋白類結(jié)構(gòu)組成，屬于脂溶性，而吲哚美辛分子-離子形式本身具有更明顯的水溶性，會(huì)阻礙藥物透過(guò)角質(zhì)層。因此，在溶解性與脂溶性兩者之間存在一個(gè)平衡界限，即提高藥物溶解性與保持藥物脂溶性之間平衡最佳值，以Kapp表示。本研究結(jié)果表明，吲哚美辛存在pH 7.3臨界值與Kapp為3.34，兩者恰相一致。

本研究回歸分析結(jié)果表明，指數(shù)模型基本可以用于預(yù)測(cè)分析pH、Kapp、溶解度與離體透皮參數(shù)間的變化趨勢(shì)?；贐CS，通過(guò)建立pH與Kapp、溶解度曲線、透皮參數(shù)之間數(shù)學(xué)模型關(guān)系，計(jì)算獲得最佳pH、Kapp，獲得酸堿性藥物最優(yōu)透皮效果，即通過(guò)回歸模型計(jì)算獲得最佳pH、Kapp，再通過(guò)制劑手段改善藥物分子-離子存在形式，以提高藥物透皮吸收。

綜上，調(diào)節(jié)pH，可改善吲哚美辛的溶解度與Kapp；調(diào)節(jié)分子-離子存在形式，可提高吲哚美辛的Q和Js。

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Effects of pH Value on Physicochemical Property and in vitro Transdermal Parameters of Indomethacin

ZHANG Yongping，XU Jian，WU Jinglan，XIE Weijie（School of Pharmacy，Guiyang College of TCM，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To study effects of different pH values on physicochemical property and in vitro transdermal parameters of indomethacin.METHODS：HPLC method was used for quantitative analysis；solubility，apparent partition coefficient（Kapp）and in vitro transdermal parameters[permeation rate（Js）and 4，12，24 h accumulative premeation amount（Q4h，Q12h，Q24h）]of Indomethacin gel were determined at pH 5.0，5.8，6.5，7.3，8.0.The multiple correlation analysis and regression model were used to determine the correlations of pH，solubility，Kappand transdermal parameters.RESULTS：Indomethacin gel in vitro transdermal model fully complied with zero-order kinetic model；and pH was good linear relationship with solubility and Kapp（r≥0.892 0），showing good correlation（r≥0.968 0）；the exponential model relationships were shown among pH，solubility，Kappand in vitro transdermal parameters；using pH 7.3 as the critical point，corresponding Kappwas equal to 3.34.CONCLUSIONS：Adjusting pH can improve the solubility and Kappof indomethacin；adjusting existing form of molecular ion can increase Q and Jsof indomethacin.

pH；Indomethacin；Physicochemical property；in vitro transdermal parameters；Correlation

R913

A

1001-0408（2016）34-4770-04

2016-02-26

2016-05-13）

（編輯：鄒麗娟）

貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.黔科合人才〔2015〕4030號(hào)）

＊教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物新制劑與新劑型。E-mail：zgygpg@126.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥物新制劑與新劑型。E-mail：twt8489@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.06