劉 佩,鄭國(guó)華,吳 勇,譚永霞,張寶徽(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430065)
霉茶總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟的保護(hù)作用及機(jī)制研究Δ
劉 佩*,鄭國(guó)華,吳 勇,譚永霞,張寶徽#(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430065)
目的:觀察霉茶總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。方法:將50只SHR按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、復(fù)方羅布麻片組(陽(yáng)性藥物,50 mg/kg)和霉茶總黃酮低、中、高劑量組(90、180、360 mg/kg),每組10只。各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物,模型組大鼠ig等體積蒸餾水,每天2次,連續(xù)7周。測(cè)定大鼠血壓并計(jì)算大鼠心臟指數(shù);采用蘇木精-伊紅染色法觀察心臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮合成酶(CYP11B2)mRNA的表達(dá)。結(jié)果:霉茶總黃酮可明顯降低SHR血壓(P<0.01),改善SHR心臟組織細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、固縮和組織纖維增生等炎性病變,降低SHR心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論:霉茶總黃酮對(duì)SHR心臟有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與下調(diào)心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA表達(dá)有關(guān)。
霉茶總黃酮;自發(fā)性高血壓大鼠;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶;血管緊張素Ⅱ;醛固酮合成酶
霉茶系葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄(Ampelopsis megalophylla Diels et.Gilg)的枝葉加工而成的一種傳統(tǒng)中草藥,被收載于《湖北中草藥志》,是一種民間藥用植物。在湖北恩施地區(qū),其是一種藥食兩用的植物資源,民間將其葉放置在沸水中稍燙,然后即時(shí)撈起瀝干,攤放在通風(fēng)處直到表面上出現(xiàn)白霉,開水泡服,用于治療高血壓、暈眩目脹等癥[1-2]。湖北中醫(yī)藥大學(xué)鄭國(guó)華教授等對(duì)霉茶抗高血壓的有效部位進(jìn)行了化學(xué)成分分離、鑒定以及藥理篩選等研究,認(rèn)為霉茶抗高血壓的主要有效成分是總黃酮。大量的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明,黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等藥理作用[3-4]。鑒于此,本研究擬觀察霉茶總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟的保護(hù)作用,并測(cè)定心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、血管緊張素(Ang)Ⅱ和醛固酮合成酶(CYP11B2)mRNA的表達(dá)水平,初步探討其作用機(jī)制,以期為霉茶治療高血壓和合理開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 儀器
BP-98A全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(北京軟隆科技有限公司);CR21GⅡ低溫高速離心機(jī)(日本Hitachi公司);FA210N精密電子天平(上海菁海儀器有公司);MyIQ2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
1.2 藥品與試劑
霉茶總黃酮(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室提供,批號(hào):20140310,規(guī)格:總黃酮含量為86.74%);復(fù)方羅布麻片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):130525;規(guī)格:0.218 5 g/片);4%多聚甲醛(武漢谷歌生物工程有限公司,批號(hào):20140317);無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);AZfreshTM總RNA小量提取試劑盒、AZpolarisTMcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞典Azanno公司,批號(hào):B1104118、C0122104)。
1.3 動(dòng)物
SHR 50只,SPF級(jí),♂,體質(zhì)量180~200 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001]。大鼠分籠飼養(yǎng)在22~24℃環(huán)境下,期間喂以普通飼料和清水。
2.1 分組與給藥
50只SHR適應(yīng)性飼養(yǎng)及血壓測(cè)量訓(xùn)練3周后隨機(jī)分為5組,分別為模型組(蒸餾水)、復(fù)方羅布麻片組(陽(yáng)性藥物,50 mg/kg)和霉茶總黃酮低、中、高劑量組(90、180、360 mg/kg,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)[5]設(shè)定),每組10只。各組大鼠每天上午9:00和下午4:00各ig給藥1次,給藥體積均為10 ml/kg,連續(xù)7周。
2.2 一般情況觀察及血壓測(cè)定
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察并記錄各組大鼠的排泄物、攝食量及飲水量等日?;厩闆r,并每周測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量1次。分別于給藥前和給藥后1、3、5、7周采用全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)定各組大鼠血壓(mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa)。
2.3 心臟指數(shù)的測(cè)定及心臟組織病理學(xué)的檢查
末次給藥前12 h禁食不禁水,末次給藥后1 h處死大鼠,迅速鈍性剝離心臟組織,用生理鹽水清洗后用濾紙吸干水分,精密稱質(zhì)量,計(jì)算心臟指數(shù)[心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)]。取部分心臟組織,用4%多聚甲醛固定,常規(guī)制作石蠟切片,蘇木精-伊紅染色作病理組織學(xué)檢查;剩余部分心臟組織于-80℃條件下保存,備用。
2.4 心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)
每組隨機(jī)選取5個(gè)組織樣本,每個(gè)樣本取量約100 mg,迅速用液氮研磨成粉末后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,按AZfreshTM總RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取總RNA。引物序列由上海Invitrogen公司檢驗(yàn)及合成,經(jīng)Blast進(jìn)行同源比較以確保其特異性。按照AZpolarisTMcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中說(shuō)明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),PCR反應(yīng)混合液總體系為20 μl。循環(huán)條件:95℃、2 min;95℃、10 s,62℃、15 s,72℃、15 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后55℃、10 s考察融解曲線,共進(jìn)行81個(gè)循環(huán)。以收集的較強(qiáng)的熒光信號(hào)和融解曲線單一峰為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),將內(nèi)參基因β-actin與目的基因同時(shí)擴(kuò)增,以2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。
表1 PCR引物序列與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab 1 PCR primer sequence and amplified fragment length
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
3.1 一般情況觀察結(jié)果
實(shí)驗(yàn)期間,各組大鼠攝食量、飲水量均正常,每日的飲水、飲食量變化不大。大便成形,毛色光滑且有光澤,腰背平直,精神狀態(tài)良好。灌胃時(shí)反抗力不大,性情一直較溫和,體質(zhì)量均正常增長(zhǎng)。各組大鼠在體征上并無(wú)明顯的差異。
3.2 各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果
給藥前,各組大鼠血壓之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥3、5、7周后,各給藥組大鼠血壓較模型組明顯降低(P<0.01),這說(shuō)明霉茶總黃酮具有降低SHR血壓的作用。各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果見表2。
表2 各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果(±s,n=10,mm Hg)Tab 2 Blood pressure of rats in each group(±s,n=10,mm Hg)
表2 各組大鼠血壓測(cè)定結(jié)果(±s,n=10,mm Hg)Tab 2 Blood pressure of rats in each group(±s,n=10,mm Hg)
注:與模型組比較,**P<0.01Note:vs.model group,**P<0.01
組別模型組霉茶總黃酮低劑量組霉茶總黃酮中劑量組霉茶總黃酮高劑量組復(fù)方羅布麻片組劑量,mg/kg 90 180 360 50給藥前181.7±8.5 184.4±9.5 186.6±7.8 188.0±10.6 182.1±5.2給藥后第1周191.1±7.8 188.3±11.9 188.9±9.0 186.8±8.6 189.5±7.4第3周205.5±4.6 187.1±8.5**188.1±8.2**184.9±7.4**184.5±8.2**第5周206.8±8.0 185.8±3.5**185.3±6.2**182.1±5.0**182.4±5.8**第7周207.5±6.5 184.1±4.0**183.9±5.5**181.4±4.6**181.2±3.9**
3.3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果
模型組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)有明顯的炎癥病變癥狀,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,多數(shù)胞核變形、固縮;組織纖維增生,發(fā)生變性。與模型組比較,霉茶總黃酮低劑量組大鼠對(duì)心臟的改善作用較小,仍可見較多的細(xì)胞核變形、固縮;霉茶總黃酮高、中劑量組和復(fù)方羅布麻片組大鼠的心臟組織炎癥病變有一定的改善,細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,組織纖維化有所好轉(zhuǎn)。這提示霉茶總黃酮高、中劑量對(duì)SHR的心臟具有一定的保護(hù)作用。各組大鼠心臟組織的HE染色圖見圖1。
圖1 各組大鼠心臟組織的HE染色圖(×200)Fig 1 HE staining of cardiac tissue of rats in each group(× 200)
3.4 各組大鼠心臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果
與模型組[(3.65±0.15)mg/g]比較,霉茶總黃酮低、中、高劑量組和復(fù)方羅布麻片組大鼠心臟指數(shù)[依次為(3.69±0.20)、(3.68±0.28)、(3.56±0.11)、(3.58±0.18)mg/g]差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3.5 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果
與模型組比較,霉茶總黃酮各劑量組大鼠心臟組織中ACE mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01),霉茶總黃酮中、高劑量組和復(fù)方羅布麻片組大鼠心臟組織中AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表3。
表3 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)Tab 3 mRNA expression levels of ACE,AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue of rats in each grou(p±s,n=10)
表3 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)Tab 3 mRNA expression levels of ACE,AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue of rats in each grou(p±s,n=10)
注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01Note:vs.model group,*P<0.05,**P<0.01
組別模型組霉茶總黃酮低劑量組霉茶總黃酮中劑量組霉茶總黃酮高劑量組復(fù)方羅布麻片組90 180 360 50 1.012±0.183 0.831±0.104*0.614±0.061**0.487±0.101**1.196±0.241 1.007±0.068 0.948±0.075 0.837±0.099*0.674±0.136**0.776±0.069**1.029±0.049 0.926±0.042 0.602±0.032**0.439±0.058**0.527±0.027**?jiǎng)┝浚琺g/kg ACE AngⅡCYP11B2
全世界有超過(guò)三分之一的成年人患有高血壓,高血壓可引起心臟病、中風(fēng)等疾病和過(guò)早死亡[6]。高血壓主要危害是造成靶器官的損害,而心臟是靶器官之一,高血壓對(duì)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、代謝和心肌間質(zhì)都有一定的影響[7]。降壓治療不僅要能有效控制血壓,也應(yīng)對(duì)心臟這類靶器官起保護(hù)作用。故本研究以SHR為模型動(dòng)物,經(jīng)ig給予霉茶總黃酮后,第3周開始大鼠血壓明顯降低,這表明霉茶總黃酮有明顯的降壓作用。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,經(jīng)霉茶總黃酮高、中劑量治療后,大鼠心肌中組織纖維化程度降低,炎癥病變得到一定的改善。這一研究結(jié)果顯示,霉茶總黃酮具有一定的心臟保護(hù)作用。
復(fù)方羅布麻片中主要成分為羅布麻,其具有降壓平穩(wěn)、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。羅布麻化學(xué)成分包括黃酮類、鞣質(zhì)類、酸類、氨基酸類等,其中黃酮類成分是主要的化學(xué)成分,而且該類成分極有可能是發(fā)揮降壓作用的功效成分[8]。此藥和民間傳統(tǒng)中草藥同用而達(dá)到降壓功效,效果良好,常用作陽(yáng)性對(duì)照藥物,故本研究選其作為陽(yáng)性對(duì)照藥。
腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在維持生理狀態(tài)下體內(nèi)的電解質(zhì)穩(wěn)定、體液平衡、調(diào)節(jié)血壓以及調(diào)控心腎靶器官結(jié)構(gòu)功能等方面中扮演著非常重要的角色。RAS主要是由腎素、血管緊張素原、ACE、Ang和其相應(yīng)的受體構(gòu)成的。RAS是參與高血壓形成、發(fā)展的重要體液調(diào)節(jié)因子,RAS的過(guò)度激活是高血壓及其他心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要決定因素,并且已經(jīng)成為高血壓治療的重要靶點(diǎn)[9]。從理論上講,阻斷RAS中的任一環(huán)節(jié),對(duì)治療高血壓都是有益的,而其中AngⅡ與ACE在這一系統(tǒng)中起著更為重要的作用。ACE可使AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ,而AngⅡ是系統(tǒng)中的主要生物活性肽,可強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮,直接參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展,其在循環(huán)和局部RAS中均發(fā)揮著最重要的病理生理作用[10]。研究表明,AngⅡ受體可介導(dǎo)心肌細(xì)胞增生肥大[11],而AngⅡ與心臟成纖維細(xì)胞表面受體結(jié)合,能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[12],兩者共同作用導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多,心肌細(xì)胞發(fā)生生理、病理性改變。而CYP11B2為腎素-Ang-CYP11B2中關(guān)鍵組成部分,長(zhǎng)時(shí)間的血漿內(nèi)高CYP11B2水平會(huì)增加循環(huán)血量,導(dǎo)致血壓升高,刺激心肌纖維細(xì)胞,引起心臟肥厚、心肌纖維化及充血性心力衰竭[13]。因此,減少ACE、AngⅡ和CYP11B2的產(chǎn)生是對(duì)抗高血壓和保護(hù)心臟的有效措施。本研究結(jié)果顯示,各給藥組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA表達(dá)水平均有不同程度的降低,特別是高劑量的霉茶總黃酮下調(diào)ACE和AngⅡ表達(dá)的效果非常明顯。這提示霉茶總黃酮可能是通過(guò)抑制腎素-Ang系統(tǒng),從而起到降壓和保護(hù)心臟的作用。
綜上所述,霉茶總黃酮對(duì)SHR心臟具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制與其下調(diào)心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA的表達(dá),抑制RAS系統(tǒng)活性有關(guān)。
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Study on the Protective Effect of Total Flavonoids from Ampelopsis megalophyllaon on Cardiac Tissue of Spontaneous Hypertensive Rat and Its Mechanism
LIU Pei,ZHENG Guohua,WU Yong,TAN Yongxia,ZHANG Baohui(Key Lab of TCM Resource and Compound Prescription Ministry of Education/Hubei Co-innovation Center for TCM New Products of Senile Diseases,Hubei University of TCM,Wuhan 430065,China)
OBJECTIVE:To observe the protective effect of total flavonoids from Ampelopsis megalophylla on cardiac tissue of spontaneously hypertensive rats(SHR),and to investigate its mechanism.METHODS:50 SHRs were randomly divided into model group,Compound apocynum tablets group(positive drug,50 mg/kg)and total flavonoids from A.megalophylla low-dose,medium-dose and high-dose groups(90,180,360 mg/kg),with 10 rats in each group.The rats were given relevant medicine intragastrically,and model group was given constant volume of distilled water intragastrically,twice a day,for consecutive 7 weeks.Blood pressure of rats were determined and cardiac index of rats were calculated;the morphology and structure of cardiac tissue were observed by HE staining.mRNA expression of ACE,AngⅡ and CYP11B2 in cardiac tissues were determined by RT-PCR.RESULTS:Total flavonoids from A.megalophylla can significantly decrease the blood pressure of SHR(P<0.01),improve the flammatory lesions of hearte issue such as irregular cell morphology,cell shrinkage,proliferation of fibrous tissue and so on,and it also can significantly decrease the mRNA expression levels of ACE,AngⅡ,CYP11B2 in cardiac tissue of rats(P<0.05 or P<0.01).CONCLUSIONS:Total flavonoids from A.megalophylla can protect cardiac tissue of SHR,the mechanism of which may be associated with down-regulating mRNA expression of ACE,AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue.
Total flavonoids from Ampelopsis megalophylla;Spontaneous hypertensive rats;ACE;AngⅡ;CYP11B2
R285
A
1001-0408(2016)34-4767-04
2016-06-13
2016-08-25)
(編輯:林 靜)
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173502)
*碩士研究生。研究方向:中藥新制劑、新劑型的研究。E-mail:84358037@qq.com
#通信作者:副教授,博士。研究方向:中藥制劑。E-mail:24662873@qq.com
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.05