王艷玲，黃曉巍，李 哲，何 璐，徐 巖，曲曉波（.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 300；.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 307）

鹿茸多肽誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制研究Δ

王艷玲1＊，黃曉巍2，李 哲1，何 璐1，徐 巖2，曲曉波2（#1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

目的：探討鹿茸多肽誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞（CSCs）向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制。方法：從SD大鼠體內(nèi)分離CSCs，鑒定后培養(yǎng)傳代至P3代后，分為空白對(duì)照組、5-氮胞苷誘導(dǎo)組（3 μmol/L）、鹿茸多肽誘導(dǎo)組（800 μg/ml）及其聯(lián)合誘導(dǎo)組，除空白對(duì)照組細(xì)胞只加含3%胎牛血清的培養(yǎng)液外，其余各組細(xì)胞加入含相應(yīng)誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d。采用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞表面心肌肌鈣蛋白T（cTnT）表達(dá)，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞cTnT、活化復(fù)制因子2（ATF-2）和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（MEF-2C）表達(dá)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞cTnT和轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)。結(jié)果：成功制得CSCs，純度＞97%。與空白對(duì)照組（cTnT呈陰性）比較，各誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT呈陽性，cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)和cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）。與5-氮胞苷誘導(dǎo)組比較，鹿茸多肽誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、MEF-2C蛋白表達(dá)和cTnT、GATA4 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05），聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)和cTnT、GATA4 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論：鹿茸多肽可能通過增強(qiáng)Nkx2.5、GATA4、ATF-2、MEF-2C等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來誘導(dǎo)CSCs向心肌細(xì)胞分化。

鹿茸多肽；心肌干細(xì)胞；心肌細(xì)胞；分化

心肌細(xì)胞死亡多發(fā)于缺血性心臟病和心力衰竭患者，最終導(dǎo)致功能性心肌細(xì)胞受損[1-2]。因此，如何通過增加心肌細(xì)胞數(shù)量來促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，恢復(fù)心臟功能的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著細(xì)胞移植療法研究的不斷深入，心臟損傷疾病的治療有了希望。心肌干細(xì)胞（CSCs）由于具有向心肌細(xì)胞分化的潛能和生理學(xué)特性，被認(rèn)為是一個(gè)理想的種子細(xì)胞[3]。CSCs在移植后可以分化成為心肌細(xì)胞修復(fù)心肌組織損傷，因此其在心肌細(xì)胞替代治療方面受到了廣泛關(guān)注。但如何通過小分子藥物激活患者的CSCs，讓其充分增殖和分化，是CSCs研究的重點(diǎn)之一[4]。多種物質(zhì)可誘導(dǎo)CSCs分化為心肌細(xì)胞[5]，但均存在不足。因此，發(fā)現(xiàn)新的誘導(dǎo)劑，建立穩(wěn)定、安全、有效、定向誘導(dǎo)CSCs分化為心肌細(xì)胞的方法成為研究的重點(diǎn)。

本研究組多年來一直從事鹿茸多肽的開發(fā)利用研究，已經(jīng)證明從新鮮鹿茸中分離提取的鹿茸多肽是具有較強(qiáng)生物活性的多肽混合物，對(duì)神經(jīng)纖維、骨組織損傷的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用[6]。本文研究的核心思路是使用體外培養(yǎng)技術(shù)制備大鼠CSCs，以鹿茸多肽作為誘導(dǎo)劑進(jìn)一步研究其對(duì)心肌細(xì)胞定向分化的作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Biofuge Primp R低溫離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；VDS凝膠成像系統(tǒng)（瑞典Pharmacia公司）；DT5-3低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Syngene Bio Imaging System、BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）。

1.2 藥品與試劑

鹿茸多肽（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制，批號(hào)：20150417，純度：＞97%）；5-氮胞苷（中國(guó)上海阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：B1412007，純度：＞98%）；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10099-141、31800-022）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：T0303）；抗大鼠CD45抗體、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子c-kit抗體、活化復(fù)制因子2（ATF-2）抗體、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（MEF-2C）抗體（美國(guó)Biosynthesis Biotechnology公司，批號(hào)：bs-0522r、bs-04130r、bs-0518r、bs-0672r）；抗大鼠心肌肌鈣蛋白T（cTnT）抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：F19064、A0208）；Trizol試劑（美國(guó)Life Technologies公司，批號(hào)：15596-026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：RR037A）；cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA PCR引物（中國(guó)上海生物工程有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0020160129）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（H+L）（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，批號(hào)：IH-0031）；PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：IPVH00010）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（美國(guó)Biosharp公司，批號(hào)：BL520A）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)新生Wister大鼠10只，♂，體質(zhì)量6～8 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2013-0001。

2 方法

2.1 CSCs的制備

CSCs的分離、培養(yǎng)參考王彤等[7]報(bào)道的分離方法。將大鼠乙醇浸泡消毒后，無菌取心臟。采用0.25%胰酶和0.1%的Ⅱ型膠原酶交替消化法制成心肌組織碎塊懸液，接種到50 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)過夜后，每瓶補(bǔ)加CEM培養(yǎng)液（含F(xiàn)BS、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液）3 ml后，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液，同時(shí)觀察記錄細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)變化情況。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CSCs特異性表面標(biāo)志物c-kit和CD45進(jìn)行檢測(cè)分析，以鑒定CSCs純度。

2.2 CSCs的傳代培養(yǎng)

待心臟細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，棄培養(yǎng)液，用0.05%胰酶消化細(xì)胞，用CEM培養(yǎng)液終止胰酶消化反應(yīng)。將消化細(xì)胞液離心后用CEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種到兩個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。細(xì)胞傳代到P3代即可用于試驗(yàn)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)c-kit和CD45陽性細(xì)胞占比

按流式細(xì)胞儀分析操作規(guī)程，將培養(yǎng)的原代細(xì)胞與抗c-kit和CD45抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)過夜；用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次后，分別加異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的熒光抗體，室溫孵育60 min；經(jīng)PBS/Azide液洗滌、1 000 r/min（離心半徑15.6 cm，下同）離心6 min后，棄上清，用2%多聚甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)c-kit和CD45陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其占比。

2.4 分組與給藥

P3代CSCs經(jīng)胰酶消化后，制成濃度為105ml－1的細(xì)胞懸液，分別接種到孔內(nèi)放有載玻片的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)和50 ml塑料培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁后分為4組，分別為空白對(duì)照組、5-氮胞苷誘導(dǎo)組（3 μmol/L）、鹿茸多肽誘導(dǎo)組（800 μg/ml）及其聯(lián)合誘導(dǎo)組。除空白對(duì)照組細(xì)胞只加含3%FBS的培養(yǎng)液外，其余各組細(xì)胞加含相應(yīng)藥物和3%FBS的培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2～3 d換一次培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。12孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種的細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，免疫組化染色，其余8瓶連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后收集細(xì)胞。

2.5 免疫組化染色檢測(cè)c-kit、cTnT表達(dá)

取“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)14 d后的細(xì)胞，PBS沖洗后，滴加4%多聚甲醛，室溫固定30 min；PBS清洗后，再用冰丙酮固定15 min，完成細(xì)胞膜打孔；之后依次加0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），室溫孵育20 min，使細(xì)胞脫脂；加0.3%H2O2室溫避光孵育20 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加FBS孵育20 min，封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)；加cTnT抗體孵育60 min，完成抗原抗體的特異性結(jié)合；加二抗孵育60 min，完成酶標(biāo)抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，PBS洗3次，再加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液浸染3 min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，封片。熒光顯微鏡下觀察拍照、記錄c-kit或cTnT表達(dá)情況。c-kit或cTnT表達(dá)陽性的細(xì)胞免疫熒光呈綠色熒光，采用顯微成像系統(tǒng)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

2.6 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)cTnT、ATF-2和MEF-2C蛋白表達(dá)

取“2.4”項(xiàng)下培養(yǎng)14 d后的細(xì)胞，加適量緩沖液，用超聲破碎法制備細(xì)胞勻漿，4℃下5 000 r/min離心30 min，上清用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，將樣品稀釋為1 mg/ml用于免疫印跡分析。分別吸取制得的待測(cè)蛋白樣品50 μl于1.5 ml EP管中，加等體積的上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min，3 000 r/min離心10 min后，取上清液中的蛋白用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離（分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%，在100 V的恒壓下電泳100 min）。電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，加入10 ml封閉液，封閉過夜；加入一抗特異性反應(yīng)2 h；用洗滌液搖洗5次，洗去殘留的未結(jié)合的一抗后，再加入二抗應(yīng)用液10 ml，結(jié)合反應(yīng)1 h；用洗滌液搖洗5次后，將ECL試劑A和B按1∶1比例混合后加入到雜交袋中反應(yīng)2 min，去掉膜表面液體，放于兩層塑料薄膜中間，用免疫印跡儀觀察、記錄結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)掃描結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，以cTnT、ATF-2和MEF-2C的目的條帶的吸光度值與相應(yīng)的內(nèi)參條帶的吸光度值的比值作為衡量指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析。

2.7 RT-PCR分析cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)

首先按照Trizol試劑使用操作程序提取細(xì)胞內(nèi)總RNA；然后通過逆轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA（反應(yīng)條件為37℃孵育60 min，90℃孵育5 min后，冰浴上迅速冷卻）；再通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到目的基因。實(shí)驗(yàn)中所用引物的核苷酸序列為：cTnT基因的上游引物為5′-ACCGGGCGTTGGAAATAG-3′，下游引物為5′-CATAGTGCGGGCATAGGG-3′，產(chǎn)物大小為180 bp；轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5基因的上游引物為5′-GCTACAAGTGCAAGCGACAG-3′下游引物為5′-GGGTAGGCGTTGTAGCCATA-3′，產(chǎn)物大小為184 bp；GATA4基因的上游引物為5′-CGAGGGTGAGCCTGTATGT-3′，下游引物為5′-TGCTGTGCCCATAGTGAGAT-3′，產(chǎn)物大小為281 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，上游引物為5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，下游引物為5′-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′，產(chǎn)物大小為231 bp。PCR反應(yīng)過程簡(jiǎn)述如下：首先將各引物用無DEPC水稀釋為10 pmol/L，以10×Taq酶buffer 5 μl、dNTPs（10 mmol/L）溶液2 μl、目的基因上下游引物各10 μl、內(nèi)參上下游引物各5 μl、cDNA溶液5 μl、Taq酶3 μl的順序，依次加入到0.2 ml PCR反應(yīng)管中，加入DEPC水到50 μl，點(diǎn)動(dòng)離心后，94℃預(yù)變性5 min，再擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)（循環(huán)條件：94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸2 min，最后72℃延長(zhǎng)10 min）。含有EB的2.5%瓊脂糖膠凝電泳對(duì)PCR產(chǎn)物分析，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、掃描分析。以目的基因與內(nèi)參的灰度值之比表示目的基因在條件培養(yǎng)細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)

心肌組織碎塊種植入培養(yǎng)瓶2 d后倒置顯微鏡下可見心肌組織碎塊的邊緣有細(xì)胞長(zhǎng)出，且向外發(fā)散性生長(zhǎng)。熒光染色結(jié)果顯示，P0和P1代細(xì)胞內(nèi)c-kit陽性細(xì)胞較少，細(xì)胞的大小和形狀與CSCs明顯不同；傳代至P3代后，雜細(xì)胞越來越少，最后得到純度較高的CSCs。不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)代次的CSCs形態(tài)學(xué)變化見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)代次的CSCs形態(tài)學(xué)變化（×100）Fig 1 Morphology of CSCs with different generations after culturing for different periods（×100）

3.2 CSCs純度

P0代細(xì)胞c-kit陽性細(xì)胞占比較少、CD45陽性細(xì)胞占比相對(duì)較多，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增加，c-kit陽性細(xì)胞占比明顯增高；到P3代時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞均為c-kit陽性，而CD45陽性細(xì)胞占比和雜細(xì)胞占比共占約2.7%，說明細(xì)胞經(jīng)過4次傳代后得到純化的CSCs。CSCs純度分析結(jié)果見表1。

表1 CSCs純度分析結(jié)果（±s，n＝3，%%）Tab 1 Purity of CSCs cell（s±s，n＝3，%%）

表1 CSCs純度分析結(jié)果（±s，n＝3，%%）Tab 1 Purity of CSCs cell（s±s，n＝3，%%）

細(xì)胞P0細(xì)胞P1細(xì)胞P2細(xì)胞P3細(xì)胞c-kit陽性細(xì)胞占比3.25±1.3 10.51±2.3 55.84±2.6 97.33±3.9 CD45陽性細(xì)胞占比21.69±2.5 6.67±2.2 2.47±1.1 1.23±1.3雜細(xì)胞占比73.85±4.2 82.55±3.4 40.23±2.7 1.36±1.5

3.3 cTnT表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，各誘導(dǎo)組細(xì)胞均有明顯的cTnT陽性表達(dá)（P＜0.01），其中5-氮胞苷誘導(dǎo)組和鹿茸多肽誘導(dǎo)組效果相當(dāng)，聯(lián)合誘導(dǎo)組效果最明顯。各組細(xì)胞cTnT表達(dá)的免疫熒光圖見圖2。

圖2 各組細(xì)胞cTnT表達(dá)的免疫熒光圖（×200）Fig 2 Immunofluorescence diagram of the expression of cTnT in CSCs（×200）

3.4 cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，各誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、ATF-2和MEF-2C蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與5-氮胞苷誘導(dǎo)組比較，鹿茸多肽誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、MEF-2C蛋白表達(dá)增強(qiáng)，聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）。各組CSCs細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，檢測(cè)結(jié)果見表2。

圖3 各組CSCs細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of the protein expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C in CSCs

表2 各組CSCs細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 The protein expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C in CSC（s±s，n＝3）

表2 各組CSCs細(xì)胞cTnT、ATF-2、MEF-2C蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 The protein expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C in CSC（s±s，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與5-氮胞苷誘導(dǎo)組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.5-azacitidine induction group，#P＜0.05

組別cTnT/β-actin ATF-2/β-actin MEF-2C/β-actin空白對(duì)照組5-氮胞苷誘導(dǎo)組鹿茸多肽誘導(dǎo)組聯(lián)合誘導(dǎo)組0.065±0.009 0.428±0.024＊0.758±0.013＊#1.246±0.032＊#1.343±0.025 1.857±0.015＊1.549±0.012＊2.975±0.038＊#0.051±0.011 0.133±0.016＊0.331±0.019＊#0.796±0.018＊#

3.5 cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，各誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與5-氮胞苷誘導(dǎo)組比較，鹿茸多肽誘導(dǎo)組和聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞cTnT、GATA4 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。各組CSCs細(xì)胞cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)的電泳圖見圖4，檢測(cè)結(jié)果見表3。

圖4 各組CSCs細(xì)胞cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)的電泳圖Tab 4 Electrophoretogram of mRNA expression of cTnT，Nkx2.5 and GATA4 in CSCs

表3 各組CSCs細(xì)胞cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 mRNA expression of cTnT，Nkx2.5 and GATA4 in CSCs（±s，n＝3）

表3 各組CSCs細(xì)胞cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 mRNA expression of cTnT，Nkx2.5 and GATA4 in CSCs（±s，n＝3）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與5-氮胞苷誘導(dǎo)組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.5-azacitidine induction group，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組5-氮胞苷誘導(dǎo)組鹿茸多肽誘導(dǎo)組聯(lián)合誘導(dǎo)組cTnT/GAPDH 0.073±0.015 1.133±0.022＊1.584±0.055＊#1.721±0.046＊#Nkx2.5/GAPDH 0.158±0.058 0.804±0.028＊0.796±0.017＊0.805±0.037＊GATA4/GAPDH 0.213±0.021 0.832±0.019＊0.698±0.054＊#0.122±0.043＊#

4 討論

大量的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图叭祟愋呐K疾病證實(shí)凋亡造成的心肌細(xì)胞的減少在人類多種類型的心臟疾病中占據(jù)極其關(guān)鍵的地位，并最終導(dǎo)致心臟功能的衰竭[8]；同時(shí)，由于心肌生理結(jié)構(gòu)的原因，心肌細(xì)胞的再生能力十分有限[3]，故一旦出現(xiàn)受損，心功能水平和心肌細(xì)胞數(shù)量會(huì)長(zhǎng)期處于較低水平。所以，目前臨床已經(jīng)將通過何種方法可以顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而達(dá)到恢復(fù)心臟功能的方法作為研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題。隨著細(xì)胞移植療法研究的不斷深入和臨床實(shí)踐應(yīng)用成果的取得，使心臟疾病的細(xì)胞移植治療成為可能。干細(xì)胞是來源于骨髓組織，并具有多向分化潛能的細(xì)胞，在體內(nèi)或體外均可向多譜系的細(xì)胞分化[9-11]。CSCs在移植后可以分化成為心肌細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)心肌組織損傷的修復(fù)，因此其在心肌細(xì)胞移植治療方面的應(yīng)用研究備受關(guān)注，是心肌細(xì)胞移植和心肌組織工程最具應(yīng)用前景的干細(xì)胞之一。

CSCs向心肌細(xì)胞分化必須有Nkx2.5、GATA4和MEF-2C等早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的啟動(dòng)[12]。cTnT分子的啟動(dòng)子區(qū)有GATA4和Nkx2.5結(jié)合位點(diǎn)，且GATA4的表達(dá)要先于cTnT表達(dá)，這一結(jié)果提示通過心肌特異性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，干細(xì)胞獲得心肌細(xì)胞的表型[13]。5-氮胞苷是經(jīng)典的干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，多見于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等向心肌細(xì)胞分化[14]。本試驗(yàn)應(yīng)用5-氮胞苷和鹿茸多肽誘導(dǎo)CSCs 14 d，結(jié)果顯示5-氮胞苷和鹿茸多肽誘導(dǎo)均使cTnT、ATF-2、MEF-2C、Nkx2.5和GATA4表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；而鹿茸多肽誘導(dǎo)組和5-氮胞苷誘導(dǎo)組cTnT、Nkx2.5、GATA4 mRNA的表達(dá)量幾乎一樣（P＞0.05）。這說明鹿茸多肽和5-氮胞苷具有同樣的體外誘導(dǎo)cTnT、Nkx2.5、GATA4基因表達(dá)的作用。而5-氮胞苷是化學(xué)誘導(dǎo)劑，具有一定的毒性，長(zhǎng)期使用，可能誘導(dǎo)細(xì)胞變異或死亡[15]。鹿茸多肽具有與5-氮胞苷相同的作用，但目前未見毒性報(bào)道。本研究表明，鹿茸多肽可通過誘導(dǎo)ATF-2、MEF-2C、Nkx2.5和GATA4的表達(dá)增加，促進(jìn)cTnT增高，促進(jìn)心肌細(xì)胞分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹿茸多肽誘導(dǎo)CSCs，可使c-kit陽性表達(dá)早期心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5、ATF-2、MEF-2C，從而顯示出了強(qiáng)效的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化的作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Study on the Mechanism of Differentiation from Cardiac Stem Cells into Cardiac Cells Induced by Cornu Corvi Polypeptides

WANG Yanling1，HUANG Xiaowei2，LI Zhe1，HE Lu1，XU Yan2，QU Xiaobo2（1.Basic Medical College，Jilin University，Changchun 130021，China；2.School of Pharmacy，Changchun University of TCM，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To explore the mechanism of differentiation from cardiac stem cells（CSCs）into cardiac cells induced by Cornu Corvi polypeptides.METHODS：CSCs were isolated from SD rats，and cultured to P3 generation after identification and then divided into blank control group，5-azacitidine induction group（3 μmol/L），Cornu Corvi polypeptides induction group（800 μg/ml）and combination induction group.Except blank control group was cultured with culture solution containing 3% FBS，other groups were cultured with culture solution containing relevant derivant for 14 d.The expression of cTnT was determined by immunohistochemical method；the expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C were determined by immunoblot assay；mRNA expression of cTnT，Nkx2.5 and GATA4 were detected by RT-PCR.RESULTS：CSCs were prepared successfully with purity＞97%.Compared with blank control group（cTnT being negative），cTnT of induction groups were positive，and the protein expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C and mRNA expression of cTnT，Nkx2.5 and GATA4 were all increased（P＜0.05）.Compared with 5-azacitidine induction group，the protein expression of cTnT and MEF-2C and mRNA expression of cTnT and GATA4 were decreased in Cornu Corvi polypeptide groups（P＜0.05）；the protein expression of cTnT，ATF-2 and MEF-2C and mRNA expression of cTnT and GATA4 were all increased in combination induction group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Cornu Corvi polypeptides can induce differentiation of CSCs into cardiac cells by promoting the expression of Nkx2.5，GATA4，ATF-2，MEF-2C and other transcription factors.

Cornu Corvi polypeptides；Cardiac stem cells；Cardiac cells；Differentiation

R361+.3

A

1001-0408（2016）34-4780-04

2016-03-16

2016-06-06）

（編輯：鄒麗娟）

吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（No.2014ZD6）；吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015Z062）

＊高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。研究方向：細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。電話：0431-85619783。E-mail：wangyanl@jlu.edu.cn

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥藥理學(xué)。電話：0431-86172508。E-mail：quxiaobo0504@hotmail.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.09