王冬蘭，簡 秋，鄭尊濤，宋穩(wěn)成，孫 星，朱 宏，楊邦保

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全控制技術與標準重點實驗室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(南京)，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

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水稻和土壤中呋蟲胺殘留的固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法

王冬蘭1*，簡 秋2，鄭尊濤2，宋穩(wěn)成2，孫 星1，朱 宏1，楊邦保1

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全控制技術與標準重點實驗室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(南京)，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

建立了呋蟲胺在水稻(糙米、稻殼和稻草3種基質)和土壤中殘留的液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(LC-ESI MS/MS)檢測方法。各基質經(jīng)乙腈提取，PSA柱凈化后，以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離，電噴霧電離串聯(lián)質譜正離子多重反應監(jiān)測(MRM)模式進行測定。在不同加標水平下，對呋蟲胺在4種不同基質中的回收率和相對標準偏差(RSD) 進行測定。結果表明，呋蟲胺在糙米中的回收率為73.8%～97.2%，RSD為3.1%～9.9%；在稻殼中的回收率為77.6%～80.3%，RSD為2.5%～5.8%；在稻草中的回收率為76.0%～94.0%，RSD為4.8%～8.8%；在土壤中的回收率為83.6%～93.3%，RSD為4.6%～6.4%。該方法具有樣品前處理簡單、快速、分析時間短的特點，靈敏度、準確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

呋蟲胺；水稻；土壤；固相萃取；液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)

呋蟲胺(Dinotefuran)是日本三井東壓化學株式會社開發(fā)，并在2002年上市的新型煙堿類殺蟲劑，是唯一不含氯原子和芳環(huán)的新型煙堿，其特征取代基為(四氫-3-呋喃)-甲基，被稱為第三代煙堿類殺蟲劑[1-2]。其殺蟲機理為通過作用于乙酰膽堿受體(AChR)，與激動劑(AC1)競爭AChR上的結合位點，使昆蟲不斷出現(xiàn)神經(jīng)沖動從而阻斷正常的神經(jīng)傳遞，使昆蟲死亡。從與受體的結合活性看，呋蟲胺比其它新煙堿類的殺蟲劑差兩位數(shù)以上，經(jīng)分析，其可能與還存在其他結合位點有關[3-5]。該藥殺蟲譜很廣，不僅可作為農(nóng)用殺蟲劑防治水稻、蔬菜和水果上的各種害蟲(如飛虱、蚜蟲、葉蟬、粉虱、跳甲等)，還可用于衛(wèi)生害蟲的防治，作用于已對其它殺蟲劑產(chǎn)生抗性的蚊子時效果良好[6-10]。目前該藥在我國登記的產(chǎn)品共4個，劑型主要為可溶性粒劑、水分散粒劑和可濕性粉劑，登記作物為水稻和黃瓜[11]，但尚未制定其在這2種農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量標準，美國和歐盟也未制定，而日本對該藥在糙米中的最大殘留限量標準值為2 mg/kg。Hem等[12]采用LC-MS/MS方法分析了辣椒中的呋蟲胺，Rahman等[13]報道了甜瓜中呋蟲胺的LC-MS/MS分析方法，Rahman等[14]研究了茶葉中呋蟲胺殘留分析的基質效應，Watanabe等[15]在2011年開發(fā)了呋蟲胺的酶聯(lián)免疫分析方法。但水稻(糙米、稻殼和稻草)和土壤中呋蟲胺的殘留分析方法尚未見報道，且Hem等[12]開發(fā)的方法檢出限和定量下限分別為0.05 mg/kg和0.15 mg/kg，該方法不夠靈敏。為評價該藥在食品和環(huán)境中的安全性，制定其在農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量標準，有必要開展呋蟲胺在水稻和土壤中的殘留檢測方法研究。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200SL G6410A液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，N-EVAP11224孔氮吹儀(德國邦德公司)，24位SPE凈化裝置(美國色譜科公司)，SZ-120攪拌機(廣東美的生活電器制造有限公司)，IKAT18勻漿機(德國IKA公司)，JY2002電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

呋蟲胺標準品(含量98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇、丙酮(HPLC級，德國Merck公司)，氨基柱(Amino)，N-丙基乙二胺柱(PSA)、弗羅里硅土柱(Florisil)、氨基+活性碳柱(Amino-Carbon)和N-丙基乙二胺+活性碳柱(PSA-Carbon)(北京艾杰爾科技有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

精確稱取呋蟲胺標準品(精確至0.1 mg)，以乙腈溶解并定容至50.0 mL，配成標準母液(1 000 mg/L)。用流動相稀釋至100 mg/L，再分別用流動相、糙米、稻殼、莖桿和土壤4種不同空白基質提取液逐級稀釋，配制成0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L系列濃度的標準工作液。

1.3 樣品前處理

提?。簻蚀_稱取各類樣品(植株10.0 g、土壤20.0 g、糙米20.0 g、谷殼10.0 g)于100 mL三角瓶中，分別加入40 mL不同提取溶液(乙腈、甲醇和丙酮)，振蕩提取2 h，過濾，取濾液1 mL待凈化。

凈化：PSA小柱經(jīng)4 mL丙酮活化后，將1 mL提取液轉入活化小柱中并收集濾液。再加入10 mL丙酮進行洗脫，收集合并洗脫液，氮吹至干，以1 mL乙腈定容，待測。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm，粒徑3.5 μm)及ZORBAX SB-Aq Narrow-Bore Guard Column(2.1 mm×12.5 mm,5 μm,預柱)。流動相：乙腈-水(70∶30)，流速：0.3 mL/min，進樣體積：5.0 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子電離(ESI+)模式；離子源溫度350 ℃；霧化氣壓力40 psi；毛細管電壓為4.0 kV；去溶氣流速：10 L/min；去溶氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；在分析過程中，采用多反應監(jiān)測模式(MRM)，以保留時間和離子對信息進行定性分析；以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。在上述儀器條件下，呋蟲胺的保留時間為3.5 min左右，呋蟲胺的監(jiān)測母離子(m/z)為203，定性子離子(m/z)為129和157，定量子離子(m/z)為157,碰撞能量均為8 V。

圖1 不同提取溶劑時的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of different solutions

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇依據(jù)是目標組分以及所測樣品的性質[16]。農(nóng)藥殘留檢測常用的提取劑有乙腈、丙酮、甲醇等[17]。在0.01 mg/kg加標水平下，不同溶劑(乙腈、丙酮、甲醇)對糙米、稻殼、稻草和土壤中呋蟲胺殘留的提取效率見圖1。結果表明，乙腈對以上4種不同基質中呋蟲胺殘留的提取效率最高(76%～87%)，而甲醇的提取效率最差(10%～63%)，丙酮對稻草中呋蟲胺的提取效率為32%，而對另外3種基質中呋蟲胺的提取效率為73%～84%。由于呋蟲胺在水中和不同有機溶劑中的溶解度差異較大，如20 ℃時其溶解度在水中為40 g/L ，在二甲苯中為73 mg/L，在丙酮中為8 g/L，在甲醇中為57 g/L，但難溶于正己烷和環(huán)己烷等有機物。同時由于甲醇與水互溶，且稻草含水量比其他基質高，導致提取液體積的變化(增大)比其他基質更大，因此甲醇對稻草中呋蟲胺的提取效率最差。因此,本實驗選用乙腈作為4種不同基質中呋蟲胺殘留的提取溶劑。

2.2 SPE凈化柱的選擇

分別選用氨基柱(Amino)、N-丙基乙二胺柱(PSA)、弗羅里硅土柱(Florisil)、氨基+活性碳柱(Amino-carbon)和N-丙基乙二胺+活性碳柱(PSA-carbon) 5種凈化柱對糙米、稻殼、稻草和土壤4種基質中的呋蟲胺進行凈化，以丙酮作為洗脫溶劑。結果表明，在0.01 mg/kg加標水平下，PSA小柱對不同基質提取液中呋蟲胺的凈化效果好，回收率高(74%～87%)；Amino小柱對4種基質提取液中呋蟲胺的回收率較低(55%～67%)；由于活性碳可能會對呋蟲胺有吸附作用，因此2種含活性碳的凈化小柱(Amino-carbon，PSA-carbon)與Florisil小柱對呋蟲胺的回收率最低(41%～55%)。因此本研究選用PSA凈化小柱作為不同基質提取液的SPE凈化小柱。

2.3 洗脫液的選擇

固相萃取的洗脫液一般選擇甲醇、乙腈或丙酮，本研究分別選用丙酮、乙腈、甲醇和乙腈-丙酮(1∶1)作為PSA凈化小柱洗脫液。結果表明，丙酮洗脫液對糙米、稻殼、稻草和土壤4種基質中呋蟲胺的回收率最高(77%～87%)；乙腈及乙腈-丙酮(1∶1)洗脫液對4種基質中呋蟲胺的回收率相近(48%～67%)；但采用甲醇作為洗脫液時，對呋蟲胺的回收率最差(23%～33%)。因此本文選用丙酮作為PSA凈化小柱的洗脫液。

表1 呋蟲胺在不同溶劑中的標準曲線參數(shù)

Table 1 Parameters of linear curves of dinotefuran dissolved in different solvents

SolventRegressionequationr2Mobilephasey=17924999x-1380209959Extractfrombrownricey=5708594x+3822309995Extractfromhully=5022910x+4851109995Extractfromstrawy=3584122x+232509996Extractfromsoily=101169462x-4088309994

*y:peak area;x:mass concentration,mg/L

圖2 呋蟲胺在流動相中的色譜圖(0.01 mg/L)Fig.2 Typical chromatogram of dinotefuran(0.01 mg/L)

2.4 線性范圍與檢出限

以乙腈作為提取液，PSA填料小柱作為SPE凈化柱，丙酮作為SPE洗脫液，分別用流動相、糙米空白基質提取液、稻殼空白基質提取液、稻草空白基質提取液和土壤空白基質提取液配制0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L的系列濃度標準溶液，進樣量5.0 μL，平行測定3次。當呋蟲胺的質量濃度為0.01～0.5 mg/L時，呋蟲胺在流動相和不同基質中的線性回歸方程見表1。結果表明，與流動相相比，糙米、稻殼和稻草基質的檢測基質效應較大，而土壤基質效應較小。呋蟲胺在不同基質中的檢出限(按信噪比S/N=3計)均為0.05 ng。呋蟲胺在流動相中的色譜圖見圖2。

2.5 回收率、精密度與最低檢測濃度

用對照水稻和土壤樣品進行呋蟲胺標準溶液的加標回收率實驗，每個加標水平重復5次。在空白稻殼、稻草和土壤中分別添加0.01，0.05，0.5 mg/kg 3個水平，糙米中添加0.01，0.05，0.5，2.0 mg/kg 4個水平時，呋蟲胺在稻殼中的回收率為77.6%～80.3%，RSD為2.5%～5.8%；在稻草中的回收率為76.0%～94.0%，RSD為4.8%～8.8%；在土壤中的回收率為83.6%～93.3%，RSD為4.6%～6.4%；在糙米中的回收率為73.8%～97.2%，RSD為3.1%～9.9%(表2)。呋蟲胺在4種基質中的最低檢測濃度均為0.01 mg/kg,回收率和RSD均符合NY/T 788-2004《農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求[18]。

表2 呋蟲胺在水稻和土壤中的加標回收率與相對標準偏差(n=5)

Table 2 Recoveries and RSDs of dinotefuran in rice and soil(n=5)

MatrixSpiked(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Brownrice001，005，05，20764，972，738，84199，43，31，54Hull001，005，05776，803，77925，58，46Straw001，005，05760，875，94048，53，88Soil001，005，05933，878，83646，62，64

2.6 實際樣品的測定

采用本文建立的方法，對南京市農(nóng)貿(mào)市場所銷售的10批次大米樣品和南京市郊區(qū)種植水稻地的土壤(5個不同田間點)樣品中的呋蟲胺殘留量進行了分析。結果表明，10批次大米和土壤中均未檢出呋蟲胺殘留(<0.01 mg/kg)。

3 結 論

本研究采用乙腈提取，PSA SPE柱凈化，液相色譜分離，串聯(lián)四極桿質譜檢測，成功建立了糙米、稻殼、稻草和土壤4種基質中殺蟲劑呋蟲胺的快速檢測方法。在0.01～2.0 mg/kg加標水平下，呋蟲胺在上述4種基質中的回收率為73.8%～97.2%，RSD為2.5%～9.9%。該方法具有操作簡單、分離效果好、線性范圍寬、回收率高、精密度好和分析效率高等特點，適用于水稻中呋蟲胺殘留的市場監(jiān)測及該藥的殘留登記試驗。

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Analytical Method for Determination of Dinotefuran Residues in Rice and Soil by SPE/HPLC-MS/MS

WANG Dong-lan1*,JIAN Qiu2,ZHENG Zun-tao2,SONG Wen-cheng2,SUN Xing1,ZHU Hong1，YANG Bang-bao1

(1.Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality,Ministry of Agriculture, P.R.China/Key Lab of Agro-product Safety Risk Evaluation(Nanjing),Ministry of Agriculture,P.R.China, Nanjing 210014,China；2.Institute for the Control of Agrochemicals,Ministry of Agriculture,P.R.China， Beijing 100125,China)

A simple and sensitive method was developed for the determination of dinotefuran residues in brown rice,hull,straw and soil.The residues of dinotefuran in different matrix were extracted with acetonitrile.After cleaned with PSA column,the extract was separated on an Agilent ZORBAX SB-C18analytical column,and determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The method was validated at different fortification levels in brown rice,hull,straw and soils.The recoveries for brown rice at three fortification levels ranged from 73.8% to 97.2% with relative standard deviations(RSDs) not more than 9.9%.The recoveries for hull were between 77.6% and 80.3% with RSDs not more than 5.8%.The recoveries for straw were between 76.0% and 94.0% with RSDs not more than 8.8%.The recoveries for soil were between 83.6% and 93.3% with RSDs not more than 6.4%.The results showed that the method is simple and rapid,and its sensitivity and accuracy could meet the requirements for pesticide residue analysis.

dinotefuran; rice;soil；solid phase extraction(SPE)；liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

2015-07-07；

2015-08-21

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項目(CX(14)2060)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.017

O657.72；F767.2

A

1004-4957(2016)03-0351-04

*通訊作者：王冬蘭，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)環(huán)境安全性分析，Tel:025-84391116，E-mail:wangdonglan2013@163.com