李惠茗，張惠怡,2，賴祥文,2，梁 立,2，劉坤平,2*，茍小軍,2*

(1．成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106;2．成都大學 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610106)

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鞣酸功能化石墨烯修飾電極上蘆丁的電化學行為及靈敏檢測

李惠茗1，張惠怡1,2，賴祥文1,2，梁 立1,2，劉坤平1,2*，茍小軍1,2*

(1．成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106;2．成都大學 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610106)

以雙功能化試劑鞣酸一步還原法制備了鞣酸功能化的石墨烯納米材料(TA-G)。鞣酸不僅起到還原劑的作用，還用作功能化試劑包裹石墨烯納米片。將所制備的TA-G用于構(gòu)建蘆丁電化學傳感器,可實現(xiàn)電化學信號放大并獲得較好的檢測靈敏度。電極反應動力學結(jié)果表明，蘆丁在該修飾電極的電化學行為受表面準可逆過程控制。優(yōu)化后的實驗條件為pH 3.0，TA-G(1.0 μg/mL)的電極修飾量為8 μL，掃速為100 mV/s，富集圈數(shù)為100圈。在優(yōu)化條件下，蘆丁的還原峰電流在1.0×10-8～1.0×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，檢出限(S/N=3)為6.0×10-9mol/L。該傳感器具有較高的穩(wěn)定性、選擇性和特異性，可實現(xiàn)實際樣品中蘆丁的靈敏檢測，從而拓寬了石墨烯的應用領域并為藥物的快速檢測提供了新思路。

鞣酸石墨烯；電化學；修飾電極；蘆??；靈敏檢測

圖1 蘆丁在電極上的電極反應Fig.1 The electrode-reaction of rutin

蘆丁是一種分布廣泛的類黃酮化合物，具有較好的抗氧化性，能降低毛細血管通透性，在心血管疾病的防治中被廣泛用作臨床治療藥物[1]，其快速靈敏檢測受到了極大的關注[2]。目前，蘆丁的檢測方法主要有分光光度法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、化學發(fā)光法和電化學法[3-7]等。韋湫陽等[4]采用膠束毛細管電泳法測定了中藥復方制劑消栓通絡片中蘆丁的含量，但檢出限僅為0.3 mg/L，無法獲得較高的靈敏度。陳君等[5]采用高效液相色譜法測定了白花杜鵑葉中的蘆丁含量，其檢出限雖可達0.006 6 mg/L，但需要復雜的樣品前處理且分析時間較長。電化學方法由于具有靈敏度高、方便、快速、成本低等優(yōu)點，在藥物檢測領域獲得了廣泛的關注和應用[8]。蘆丁分子有4個酚羥基，相鄰的兩個酚羥基具有電化學活性，可在電極上發(fā)生電極反應(如圖1所示)，因此通過電化學方法可實現(xiàn)蘆丁的靈敏快速檢測[9]。為提高檢測靈敏度，隨著新型納米材料的發(fā)展及其優(yōu)異的電學性質(zhì)，多種納米材料如納米金[10]、碳納米管[11]等被引入電化學檢測平臺。納米材料獨特的物理化學性質(zhì)，可改善藥物與電極間的電子傳遞效率，從而獲得較好的分析性能。

石墨烯是2004年被發(fā)現(xiàn)的新型碳基二維納米材料[12]，具有比表面積大、導電性高等優(yōu)良性質(zhì)，已在納米電子器件[13]、傳感器[14]及復合物材料[15]等方面得到了廣泛應用。但由于純石墨烯表面官能團較少，不利于進一步應用，因此各種共價和非共價的功能化方法被用于功能化石墨烯的制備。鞣酸是一種高分子量的聚酚類化合物，其結(jié)構(gòu)中包含的兒茶酚和焦沒食子酚結(jié)構(gòu)具有一定的還原能力，因此可用于還原氧化石墨烯以制備石墨烯。同時鞣酸結(jié)構(gòu)中包含的大量苯環(huán)結(jié)構(gòu)可與石墨烯形成π-π共軛結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定石墨烯。本研究為實現(xiàn)靈敏的蘆丁電化學檢測，首先以鞣酸為還原劑和保護劑一步法制備了鞣酸功能化的石墨烯(TA-G),然后通過層層組裝技術將石墨烯組裝到電極表面構(gòu)建了蘆丁電化學傳感器，所制備的TA-G一方面具有高的導電性，可加速蘆丁在電極表面電子的傳遞速度。另一方面，TA-G具有大的比表面積，同時，其功能化的鞣酸可與蘆丁形成氫鍵，從而進一步提高蘆丁在電極表面的負載量。因此，可實現(xiàn)蘆丁電化學傳感器信號的放大從而提高蘆丁檢測的靈敏度。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

蘆丁、鱗片石墨購自Sigma-Aldrich公司。氨水和水合肼(80%)購自成都長征試劑有限公司。其它所用化學試劑均為化學純。蘆丁儲備液(1.0×10-3mol·L-1)使用甲醇配制，于4 ℃下暗處保存?zhèn)溆?。循環(huán)伏安測試于CHI 832C電化學工作站(上海辰華)上進行。采用傳統(tǒng)的三電極電化學測定體系，工作電極為玻碳電極(GCE)或鞣酸功能化石墨烯(TA-G)修飾的GCE，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑絲電極。溶液pH值均采用數(shù)字pH計(PHS-3C)測量。實驗所用超純水均取自Milli-Q純水系統(tǒng)。場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)在Kevex JSM-6701上進行。原子力顯微鏡(AFM)實驗在FP-3D-BIO上以云母片為基底進行測量。

1.2 鞣酸功能化石墨烯的制備

鞣酸功能化的石墨烯采用本課題組之前的方法進行制備[16]。其制備過程簡述如下：采用優(yōu)化的Hummers法以石墨粉為原料制備石墨氧化物(GO)[17]。然后在超聲輔助下對GO進行2 h的水相剝離，3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min除去未剝離的GO，即得剝離的氧化石墨烯納米片(EGO)分散液。將4.0 g鞣酸(TA)加入到100 mL均勻的EGO分散液中，攪拌30 min保證鞣酸完全溶解,然后升溫至95 ℃下反應9 h。經(jīng)過多步的過濾洗滌得到黑色的鞣酸功能化石墨烯(TA-G)固體，于烘箱中烘干備用。同時，不加鞣酸以水合肼為還原劑制備純石墨烯進行對比實驗。

1.3 修飾電極制備

GCE先分別用1.0，0.3，0.05 μm的Al2O3拋光粉進行拋光處理。然后依次用1∶1 HNO3、丙酮和超純水各超聲清洗3～5 min，以得到新鮮干凈的電極表面并N2吹干。準確稱取1.0 mg上述所制備的TA-G于1.0 mL甲醇中，超聲20 min得黑色均勻的TA-G分散液。吸取5 μL TA-G分散液滴涂于干凈的GCE表面，并置于干燥器中室溫下自然晾干，即得TA-G修飾電極(TA-G/GCE)。

1.4 蘆丁測定及實際樣品分析

在優(yōu)化條件下，將制備的修飾電極浸入含有蘆丁的PBS緩沖液中(0.1 mol·L-1,pH 3.0)。攪拌下采用循環(huán)伏安法(CV)掃描100圈以進行樣品富集。然后室溫下于0.1～0.8 V電位窗口采用差示脈沖伏安法(DPV)進行測量。測量后的電極浸入PBS緩沖溶液中(0.1 mol·L-1，pH 7.0)，CV連續(xù)掃描15圈即可實現(xiàn)電極再生。取商品化的蘆丁藥片(20 mg/片)1片，研磨后加入20 mL甲醇中超聲提取20 min，過濾，濾餅用10 mL甲醇沖洗3次，合并各次濾液并用甲醇定容至100 mL備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

TA-G(c)的FT-IR圖(B)

Fig.2 UV-Vis spectra(A) of TA(a)，EGO(b)，TA-G(c) and pure graphene(d),and FT-IR

spectra(B) of EGO(a),pure graphene(b) and TA-G(c)

insert:SEM of TA-G

采用掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)對TA-G的形貌進行表征。如圖2A插圖所示，TA-G的SEM照片顯示TA-G呈半透明褶皺的輕紗狀不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)。AFM可同時提供樣品形態(tài)和厚度的直觀表征。如圖3的AFM圖所示，EGO(A)表現(xiàn)出不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)，厚度分析(Cross-section analyses)表明EGO的厚度約為1.0 nm。還原后的TA-G(B)同樣表現(xiàn)出不規(guī)則的片狀結(jié)構(gòu)，但TA-G的厚度增加到約為3.0 nm。這也表明鞣酸已成功的功能化到石墨烯表面。

圖3 EGO(A)與TA-G(B)的AFM圖Fig.3 AFM images of EGO(A) and TA-G(B)

2.2 修飾電極上蘆丁的電化學行為

為對比不同電極的電化學性能，以循環(huán)伏安法(CV)測試了不同電極上蘆丁的電化學行為。如圖4A所示，在裸GCE電極上(曲線a)，無蘆丁的緩沖溶液中，未觀察到明顯的氧化還原峰。加入蘆丁后，蘆丁在裸GCE電極(曲線b)上于0.464 V和0.482 V處顯示1對強度相對較小的氧化還原峰。然而，對于TA-G修飾的GCE電極(曲線c)，蘆丁在0.452 V和0.543 V處表現(xiàn)出1對穩(wěn)定的準可逆氧化還原峰，峰峰分離度為91 mV。這表明蘆丁在TA-G/GCE修飾電極表面經(jīng)歷了快速的電子轉(zhuǎn)移過程。與裸GCE電極相比，TA-G/GCE修飾電極上蘆丁的電流信號獲得了極大的增強。其原因可能是由于TA-G的高導電性以及對蘆丁的富集作用，此外，TA-G納米材料的催化性也是重要因素。多因素的聯(lián)合作用導致了信號的雙重增強。

Fig.4 CVs of GCE(a) without rutin in 0.1 mol·L-1pH 3.0 PBS,and bare GCE(b),TA-G/GCE(c) with 1.0×10-6mol·L-1rutin (A) and CVs of TA-G/GCE with the change of scan rate(B)

進一步通過CV法考察了電位掃描速率(v)對蘆丁在該修飾電極上電化學信號的影響。如圖4B所示，蘆丁的氧化還原峰電流值及峰電位差值隨掃描速率的增加而增加。當掃描速率從10 mV·s-1增至1 000 mV·s-1時，陽極和陰極電流值均與掃描速率呈線性關系(圖5A)。這表明蘆丁在TA-G/GCE修飾電極上表現(xiàn)出一個受表面控制的準可逆電化學反應過程。將陽極(Epa)和陰極(Epc)峰電位值與掃描速率的對數(shù)(lgv)做圖，由圖5B可以看出，在高掃描速率范圍，Epa和Epc峰電位值均與lgv呈線性關系，其線性方程分別為：Epa=0.542 6+0.069 2lgv；Epc=0.418 6-0.057 4lgv。相關系數(shù)分別為0.995 0和0.991 6。根據(jù)Laviron模型[20]，計算可得電子轉(zhuǎn)移數(shù)(n)、電子轉(zhuǎn)移系數(shù)(α)及表觀速率常數(shù)(ks)分別為2,0.56和4.9 s-1。這表明蘆丁在該修飾電極上經(jīng)歷了一個快速的電子轉(zhuǎn)移電化學反應。

Fig.5 Linear plots of anode and cathode peak currentvs.scan rate(A)and plots of anodic and cathodic potentials against the logarithmic scan rate of TA-G/GCE(B)

2.3 實驗條件的優(yōu)化

對測定蘆丁溶液的pH值進行優(yōu)化，結(jié)果如圖6A所示。隨著測定體系pH值的增大，蘆丁CV圖中的還原和氧化電流均逐漸增大，pH 3.0時達到最大值，然后又逐步下降。因此，確定最優(yōu)pH值為3.0。同時，蘆丁CV圖中的氧化還原峰電位值隨pH值的增大而逐漸減小，表明蘆丁的電化學氧化還原反應中有H+質(zhì)子參與反應。將蘆丁的還原峰電位對pH值作圖，如圖6B所示，在pH 2.2～6.0范圍內(nèi)pH值與電位呈線性關系，其線性方程為：Epa=0.713 7-0.068 5×pH，相關系數(shù)(r)為0.997 7，斜率為68.5 mV,接近理論值59 mV。這表明蘆丁電化學反應中參與反應的電子數(shù)等于質(zhì)子數(shù)[21]。結(jié)合Laviron模型的計算結(jié)果，說明在TA-G/GCE修飾電極上蘆丁表現(xiàn)為兩質(zhì)子兩電子的電化學反應。此結(jié)果與文獻結(jié)果一致[22]。

Fig.6 Effect of pH values for CVs of rutin at TA-G/GCE(A)and plot of equilibrium potentialvs.pH value(B)

為在電極上獲得最大的蘆丁富集量以提高信號強度，對蘆丁的CV富集圈數(shù)進行了優(yōu)化(如圖7A)。結(jié)果表明，隨富集圈數(shù)的增大，蘆丁的還原峰電流值(I)逐漸增大，在100圈時達到最大值并保持穩(wěn)定。這表明在1.0×10-6mol·L-1濃度下，富集100圈時，蘆丁在TA-G/GCE修飾電極的信號達到最大值。因此，選定100圈為優(yōu)化的蘆丁CV富集圈數(shù)。

修飾電極上修飾的TA-G分散液體積會影響修飾膜的厚度，從而影響最終測定的電流信號強度。因此對膜厚進行了優(yōu)化，結(jié)果見圖7B。由圖可知，隨著TA-G體積的增加，電流值逐漸增大，在8 μL時達到最大值，然后逐步降低。最終選擇TA-G分散液體積為8 μL。

2.4 蘆丁檢測

在上述優(yōu)化條件下，采用差示脈沖伏安法(DPV)對不同濃度的蘆丁溶液進行測定(如圖8)。結(jié)果顯示，DPV電流值(I)與蘆丁濃度(c，mol·L-1)在1.0×10-8～1.0×10-5mol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系，其線性方程為I(μA)=0.250 9+2.887 1×cRutin,相關系數(shù)(r)為0.992 9，檢出限(S/N=3)為6.0×10-9mol·L-1。

Fig.7 Effect of CV accumulation cycle numbers(A) and film thickness of TA-G/GCE(B) on peak current of 1.0×10-6mol·L-1rutin

圖8 不同濃度蘆丁在TA-G/GCE電極上的DPV響應Fig.8 DPV curves of different rutin concentrations on TA-G/GCE rutin concentration(from low to high):1.0,5.0,10,50,100,500,1 000(×10-8 mol·L-1)；bufffer:pH 3.0 0.1 mol·L-1 PBS；insert:linear curve of DPV current response for rutin concentration

Table 1 Determination of commercial rutin tablets

No．Standardvalue(mg/sheet)Detectionvalue(mg/sheet)Recovery(%)1201895948220200910043201942971Averagevalue201949974

2.5 穩(wěn)定性與精密度

在優(yōu)化條件下，用同一支修飾電極對同一蘆丁溶液(1.0×10-6mol/L)進行6次平行測定，相對標準偏差(RSD)為3.9%；用6支修飾電極測定同一蘆丁溶液，RSD為4.7%；將修飾電極在室溫下放置2周后重新測定，RSD為4.9%。表明該修飾電極具有良好的穩(wěn)定性和重復性。同時，考察了常見干擾物質(zhì)如多巴胺(0.001 mol/L)、抗壞血酸(0.001 mol/L)及血紅蛋白(0.001 mol/L)對蘆丁測定的影響，結(jié)果表明在這3種共存干擾物存在的情況下，蘆丁的回收率均可達到95%以上，表明這3種共存物不干擾對蘆丁的測定。

2.6 實際樣品分析

在優(yōu)化測定條件下，采用本方法對蘆丁藥片提取液進行測定。由表1可見，該方法測得蘆丁藥片中蘆丁含量的平均值為19.49 mg/片，與標稱值(20 mg/片)接近，3次實驗的回收率為94.8%～100.4%，這表明所構(gòu)建的蘆丁電化學傳感器可實現(xiàn)實際樣品中蘆丁的靈敏測定。

3 結(jié) 論

本文以雙功能化試劑鞣酸還原制備了鞣酸功能化的石墨烯(TA-G)，并通過層層組裝構(gòu)建了基于TA-G的蘆丁電化學傳感器。利用該傳感器可在較寬的線性范圍內(nèi)實現(xiàn)蘆丁的快速、靈敏檢測，并具有較低的檢出限。同時，該傳感器具有較高的穩(wěn)定性、選擇性和特異性，可實現(xiàn)實際樣品中蘆丁的靈敏檢測。方法拓寬了石墨烯的應用領域并為藥物快速檢測提供了新思路。

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Electrochemical Behavior and Sensitive Detection of Rutin on Tannic Acid Functionalized Graphene Modified Electrode

LI Hui-ming1,ZHANG Hui-yi1,2,LAI Xiang-wen1,2,LIANG Li1,2,LIU Kun-ping1,2*,GOU Xiao-jun1,2*

(1.School of Bioengineering,Chengdu University,Chengdu 610106,China；2.The Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Exploitation of Higher Education Institutes of Sichuan Province,Chengdu University, Chengdu 610106,China)

In this study,tannic acid(TA) functionalized graphene nano sheets(TA-G) was facilely synthesized through a one-step green reduction method using tannic acid as dual function agent，in which tannic acid acted as not only a reduction reagent to reduce oxided graphene(EGO) but also a capping reagent to functionalize graphene.The as-prepared TA-G was used to construct a graphene based rutin electrochemical sensor,and the modified electrode had a high sensitivity for rutin detection.The results of electrode reaction kinetics of rutin on TA-G modified electeochemical sensor indicated that the electeochemical reaction of rutin on the modified electrode undergone a surface-controlled quasi-reversible electrochemical process.The optimal conditions were as follows:pH value:3.0,TA-G amount(1.0 μg/mL) on TA-G modified electrochemical sensor:8 μL,scan rate:100 mV/s,cycles of enrichment:100. Under the optimal conditions,the fabricated sensor displayed an excellent analytical performance for rutin detection,with a linear range of 1.0×10-8-1.0×10-5mol·L-1and a low detection limit of 6.0×10-9mol·L-1at 3σ.Meanwhile,the fabricated rutin electrochemical sensor also exhibited good selectivity,specificity and stability,and could be used for rutin detection in real samples.The proposed method broadened the application field of graphene and offered a new idea for rapid detection of drug.

tannic acid functionalized graphene；electrochemistry；modified electrode；rutin；sensitive detection

2015-07-05；

2015-08-15

四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術研究專項(2014F002)；四川省教育廳科研項目(15ZB0374)；成都大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(CDU_CX_2015104)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.006

O657.1;TQ460.72

A

1004-4957(2016)03-0292-07

*通訊作者：茍小軍，博士，教授，研究方向：藥物分析，Tel:028-84616301，E-mail:26118008@qq.com 劉坤平，博士，副教授，研究方向：藥物分析，Tel:028-84616301，E-mail:liukunping@cdu.edu.cn